一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用

本发明属于分子育种领域，涉及甘蓝型油菜早熟且抗寒抗冻强的油菜品种的培育，特别是指一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napus aacc 2n=38)是我国重要的油料作物，在我国的食用植物油的供应中，菜籽油的占比超过55%。然而我国食用植物油自给率逐年走低，目前已经低于40%。所以，保证油菜生产是保证我国食物植物油安全的重要部分。在长江流域开发冬闲田扩种油菜；统筹油菜综合性扶持措施，推行稻油轮作，大力开发利用冬闲田种植油菜，成了国家推动早熟油菜育种的要求。早熟油菜生育期短，开花早，容易遭遇低温胁迫，因此，利用生物育种技术培育早熟抗寒抗冻油菜新品种对解决稻油轮作茬口矛盾，利用冬闲田种植油菜具有重要的现实意义。

2、转基因生物技术是现代生物技术的核心。转基因生物技术是指利用dna重组、遗传转化等分子生物技术，将目的基因导入受体基因组中，并且目的基因能在后代中稳定表达，使受体生物获得预期的、定向的遗传改变，从而改良生物。目前，国际上转基因生物技术已经广泛应用于医药、工业、农业、环保、能源等领域，在农业领域，国际上已经培育了一大批具有抗虫、抗病、耐除草剂、优质、抗逆等优良性状的转基因作物新品种。转基因生物技术在农业领域的广泛应用，有效降低了农业生产人工成本，减少了农药使用量，减少灾害损失，在缓解资源约束、保护生态环境、改善和提高农产品质量和营养价值，推进绿色发展方面发挥了重大作用。

3、现有文献报道，在甘蓝型油菜中bnacbf4基因的表达受冷诱导，并且bnacbf4基因参与了油菜增强抗寒性的多分子途径，在胁迫的不同阶段表现为动态调控。甘蓝型油菜中bnacbf17基因可通过提高co2同化率和电子传递效率，在低温胁迫下保持光合作用系统运行。在酵母中过表达油菜bncor25基因能够显著提高细胞在冷胁迫下的存活率，在拟南芥中过表达油菜bncor25基因提高了拟南芥的抗寒抗冻性。在甘蓝型油菜中过表达拟南芥atacbp6基因具有提高甘蓝型油菜抗寒抗冻性的潜力。这些低温胁迫基因的鉴定和分析为甘蓝型油菜抗性分子设计育种提供重要基因资源。目前，在油菜中尚未有很多抗寒抗冻基因的报道，因此亟需我们开展挖掘提高甘蓝型油菜抗寒抗冻基因的相关工作。

技术实现思路

1、本发明提出一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用，发现了可以明显提高油菜在蕾薹期的抗寒抗冻性，且在遭受低温胁迫后不影响油菜正常开花，同时，能够在低温条件下明显提高油菜种子的萌发速率及发芽率。为培育抗寒抗冻早熟油菜新品种提供了新思路及新的基因资源。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在培育耐低温胁迫的甘蓝型油菜中的应用。

4、一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的萌发速率中的应用。

5、一种拟南芥蛋白基因或含有该基因的表达载体在提高低温胁迫下甘蓝型油菜种子的发芽率中的应用。

6、上述拟南芥蛋白基因为atpr4基因或atglu基因，拟南芥基因atpr4，所述atpr4基因的核苷酸序列与ensemblplants数据库数据库中at3g04720序列相同，位于第3条染色体，含有2个外显子和1个内含子。拟南芥基因atpr4，所述拟南芥基因atpr4蛋白的氨基酸序列来源于ensemblplants数据库数据库。

7、拟南芥基因atglu，所述atglu基因的核苷酸序列与ensemblplants数据库数据库中at4g16260序列相同，位于第4条染色体，含有3个外显子和2个内含子。拟南芥基因atglu，所述拟南芥基因atglu蛋白的氨基酸序列来源于ensemblplants数据库数据库。

8、上述应用是通过在甘蓝型油菜中过表达atpr4基因和/或atglu基因基因实现的。

9、上述应用是通过将含有atpr4基因和/或atglu基因的过表达载体转入甘蓝型油菜中实现的。

10、上述的应用，步骤为：

11、（1）以拟南芥的cdna为模板，以拟南芥蛋白基因的第一引物对，对目的片段进行扩增，并回收目的片段；

12、（2）以步骤（1）的目的片段为模版，以第二引物对进行扩增，并回收产物；

13、（3）pcambia3301-gfp载体经用xbai与bglii双酶切处理并回收，与步骤（2）的回收产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌，经验证后获得拟南芥蛋白基因的过表达载体；

14、（4）步骤（3）的过表达载体经农杆菌转化至油菜种子，获得耐低温的甘蓝型油菜。

15、上述步骤（1）中拟南芥蛋白基因为atpr4基因和/或atglu基因。

16、上述第一引物对为atpr4-f/atpr4-r或atglu-f/atglu-r，其中atpr4-f的核苷酸序列如seq id no.1所示、atpr4-r的核苷酸序列如seq id no.2所示、atglu-f的核苷酸序列如seq id no.3所示、atglu-r的核苷酸序列如seq id no.4所示。

17、上述步骤（2）中第二引物对为atpr4-vf/atpr4-vf或atglu-vf/atglu-vf，其中atpr4-vf的核苷酸序列如seq id no.5所示、atpr4-vf的核苷酸序列如seq id no.6所示、atglu-vf的核苷酸序列如seq id no.7所示、atglu-vf的核苷酸序列如seq id no.8所示。

18、本发明具有以下有益效果：

19、1、研究中，利用生物育种技术在早熟甘蓝型油菜（生育期110-140天）中分别过表达atpr4及atglu基因提高了甘蓝型油菜蕾薹期的抗寒抗冻性，并且在正常条件下恢复7天后85%的过表达植株能够正常生长开花，有利于早熟耐迟播且抗寒抗冻性强的油菜品种的培育。早熟油菜生育期短，开花早，容易在开花期遭遇低温胁迫。本研究在早熟油菜中分别过表达atpr4及atglu基因。通过对过表达atpr4基因研究结果看出，与野生型相比，在-3℃冻处理完成后，oe1,oe2的表型与wt的并没有明显差别，植株均出现了萎蔫，水渍化的表型。通过相对电导率的检测结果发现，wt及oe1的相对电导率均在80%左右，oe2的相对电导率为60%左右，并且oe1,oe2的相对电导率与wt并没有显著性差异。说明过表达植株与野生型植株的受冻害程度基本一致。在正常条件下恢复后，oe1,oe2植株的长势明显好于wt，并且oe1,oe2的存活率在85%左右，wt的存活率在40%左右，oe1,oe2之间的存活率没有显著性差异，两个过表达株系存活率与wt之间存在显著性差异。在恢复第7天后,oe1,oe2约80%的植株正常开花，wt有一株植株正常开花。通过对过表达atglu基因研究结果看出，与野生型相比，在-3℃冻处理完成后，通过相对电导率的检测结果发现，wt的相对电导率在80%左右，oe的相对电导率为40%左右，oe与wt的相对电导率存在显著性差异，结果说明过表达植株较野生型植株的受冻害程度轻。在正常条件下恢复后， oe植株的长势明显好于wt，并且oe的存活率在80%左右，wt的存活率在30%左右，oe的存活率比wt 高50%左右。在恢复第7天后,oe材料约80%的植株正常生长且进入开花期，wt植株趋向死亡。

20、2、在甘蓝型油菜中分别过表达atpr4及atglu基因提高了油菜的低温萌发速率及发芽率，有利于早熟油菜的迟播。为了完善稻油轮作栽培模式，油菜播期被推迟，所以，研究出早熟耐迟播且抗寒抗冻性强的油菜品种具有重要的现实意义。通过对过表达atpr4基因研究结果看出，在正常条件下，wt,oe1及oe2均在第1天种子开始萌发，且在第2天萌发率达到90%，在第3天萌发率达到100%，说明进行实验的种子材料种子发芽力基本一致。在4℃低温处理条件下，与wt相比，oe1在第4天开始发芽，oe2在第3天开始发芽，wt在第6天开始发芽，oe1,oe2比wt萌发速度快3天。oe1,oe2在第7天发芽率分别为95%及100%，wt为20%，oe1,oe2的发芽率明显高于wt。通过对过表达atglu基因研究结果看出，在正常条件下，wt,oe1及oe2均在第1天种子开始萌发，且在第2天萌发率达到90%，在第3天萌发率达到100%，说明进行实验的种子材料种子发芽力基本一致。在4℃低温处理条件下，与wt相比，oe1,oe2在第4天开始发芽， wt在第6天开始发芽，oe1,oe2比wt萌发速度快2天。oe1,oe2在第7天发芽率分别为97%及100%，wt为40%，oe1,oe2的发芽率明显高于wt。