一种全细胞催化合成N-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法与流程

本发明涉及一种全细胞催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法，属于生物催化。

背景技术：

1、n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸是一种重要的氨基酸衍生物，广泛用于医药和生物工程领域。n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸可通过酰基转移酶(acyltransferase)转移酰基供体上的乙酰基给羟脯氨酸而催化合成，但其生物催化合成常常受限于酰基转移酶酶活。因此，需要在提高酰基转移酶酶活基础上选择合适的酰基供体以提高n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸合成效率，这一问题变得尤为关键。

2、现有技术(cn113403350a)尽管已公开采用生物酶催化的方式生产n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸，但其生产酶需要从天然微生物、真菌或植物中分离提取，这通常需要昂贵设备和大量劳动力导致酶成本较高，难以满足大规模生产需要。此外，酶的稳定性和抗逆性也是需要进一步考虑的重要因素。在酶催化反应中，目的产物通常需要从反应混合物中分离和纯化，这包括去除未反应的底物、酶本身和其他杂质。分离和纯化过程通常需要耗费大量的时间和资源，这些额外的成本会对生产的经济性产生影响。大多数酶在工业规模生产中需要较长的反应时间，如何降低酶对外部条件(如温度、ph、离子浓度等)敏感性以增强其稳定性成为另外一个很重要的挑战。酶的底物选择性和催化特异性也是合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸时有待考虑的重要因素，确保不希望的副产物不生成或少生成从而有助于提高产物转化率和分离提取。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明采用全细胞催化方式合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸。通过异源表达突变酰基转移酶的基因工程菌，成功实现了n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的全细胞催化合成。进一步通过优化催化时间、菌体添加量、添加剂的种类和添加量，提高了n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量。

2、本发明的第一个目的是提供一种酰基转移酶突变体，是在野生型酰基转移酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)的基础上突变得到的，其序列如seq id no.3所示。进一步地，在seq id no.3所示酰基转移酶突变体的基础上进一步突变了第97位、第154位中任一一个或多个位点。经检测，使用表达未突变的野生型酰基转移酶(seq id no.2)的基因工程菌进行全细胞催化，未检测到产物中有n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的活，而表达酰基转移酶突变体的基因工程菌具有较好的全细胞催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的能力。

3、本发明第二个目的是提供上述酰基转移酶突变体在催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用，提供一种全细胞催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法。该方法以反式-4-羟脯氨酸为底物，使用表达酰基转移酶突变体的基因工程菌株的活体细胞催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸；所述酰基转移酶突变体的氨基酸序列如seq idno.3所示，或所述酰基转移酶突变体的氨基酸序列在seq id no.3的基础上还突变了第97位、第154位中任一一个或多个位点。

4、在一种实施方式中，所述第97位的赖氨酸突变为丙氨酸。

5、在一种实施方式中，所述第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。

6、在一种实施方式中，在第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的基础上进一步将第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。

7、在一种实施方式中，反式-4-羟脯氨酸的添加量为5～200g/l，可选地，30～50g/l。

8、在一种实施方式中，全细胞催化体系中，含有酰基供体。

9、在一种实施方式中，酰基供体的添加量为0.5～20％v/v，可选地，5～15％v/v。

10、在一种实施方式中，酰基供体可以是如下一种或者多种：乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸异丙酯、乙酸异丙烯酯、乙酸异戊酯、乙酸对硝基苯酯。

11、在一种实施方式中，全细胞催化体系中，还含有表面活性剂。

12、在一种实施方式中，表面活性剂的添加量为0.5～5％v/v，可选地，0.5～2％v/v。

13、在一种实施方式中，表面活性剂可以是如下一种或者多种：dmso、异丙醇、甘油、peg 4000、triton x-100、tween 80。

14、在一种实施方式中，基因工程菌株菌体的添加量为终浓度0.2～3*1010cfu/ml。

15、在一种实施方式中，催化合成时间为3～24h。

16、在一种实施方式中，催化合成反应在25～35℃，180～220rpm下进行。

17、在一种实施方法中，所述基因工程菌是在zybm9培养基中，于37℃，220rpm培养至od600＝0.8～1.0，添加终浓度为400μm的乳糖，于20℃，220rpm诱导培养16h，离心获得全细胞催化剂。

18、在一种实施方法中，所属的全细胞催化是将湿菌体重悬于磷酸缓冲液中，反应体系包含40g/l反式-4-羟脯氨酸，乙酸乙酯10％(v/v)，dmso 0.5-2％(v/v)，湿菌体0.2～3*1010cfu/ml。

19、本发明还提供上述突变体在合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用。

20、有益效果

21、与酶催化生产n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸不同，本发明通过构建外源表达酰基转移酶的基因工程菌，实现n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的全细胞催化，并优化催化条件，进一步提高n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的产量。本发明避免了酶催化不稳定的问题，降低酶与产物的分离成本。

22、本发明发现表达野生型酰基转移酶的基因工程菌进行全细胞催化，无法检测到n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的活性；本发明构建了酰基转移酶突变体，表达突变后的酰基转移酶的基因工程菌能够较好的催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸；本发明还进一步优化了全细胞催化的条件。

23、特别的，当底物反式-4-羟脯氨酸添加量为40g/l，乙酸乙酯添加量为10％(v/v)，dmso添加量为1％(v/v)，基因工程菌株bl21(de3)/pet22b-msact(s11c)湿菌体添加量为2*1010cfu/ml，于35℃，220rpm条件下进行反应，催化6h的情况下，n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸转化率达到0.552％，产量达到239mg/l。

技术特征：

1.一种全细胞催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸的方法，其特征在于，以反式-4-羟脯氨酸为底物，使用表达酰基转移酶突变体的基因工程菌株催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸；所述酰基转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，或所述酰基转移酶突变体的氨基酸序列在seq id no.3的基础上还突变了第97位、第154位中任一一个或多个位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第97位的赖氨酸突变为丙氨酸；所述第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在第97位的赖氨酸突变为丙氨酸的基础上进一步将第154位的苯丙氨酸突变为丙氨酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反式-4-羟脯氨酸的添加量为5～200g/l。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还添加了酰基供体；可选地，0.5～20％v/v的酰基供体。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中还添加了表面活性剂；可选地，0.5～5％v/v的表面活性剂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌株的菌体添加量为终浓度0.2～3*1010cfu/ml。

8.一种酰基转移酶突变体，其特征在于，所述酰基转移酶突变体的氨基酸序列如seqid no.3所示。

9.编码权利要求8所述突变体的核苷酸序列、携带权利要求8所述突变体序列的重组质粒或细胞。

10.权利要求8所述酰基转移酶突变体在催化合成n-乙酰基-反式-4-羟基脯氨酸中的应用。

技术总结
本发明涉及一种全细胞催化合成N‑乙酰基‑反式‑4‑羟基脯氨酸的方法，属于生物催化技术领域。本发明通过突变酰基转移酶并异源表达构建了基因工程菌，成功实现了使用全细胞催化合成N‑乙酰基‑反式‑4‑羟基脯氨酸，避免了酶不稳定的问题、降低酶与产物的分离成本。在此基础上，本发明通过优化催化时间、菌体添加量、添加剂的种类和添加量，提高了N‑乙酰基‑反式‑4‑羟基脯氨酸的产量，产量达到239mg/L。本发明是一种成本更低、设备需求低、更适合工业化生产的N‑乙酰基‑反式‑4‑羟基脯氨酸的制备方法。

技术研发人员：程景方,薛儒康,孙付保,魏川翔,孙驰贺,胡芸
受保护的技术使用者：可莱尼化妆品科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21