一种鉴别蜀羊泉的引物探针组及实时荧光PCR鉴别方法与流程

本发明属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴别蜀羊泉的引物探针组及实时荧光pcr鉴别方法。

背景技术：

1、蜀羊泉是茄科植物青杞 solanum sptemlobumbunge.的全草，始载于《神农本草经》，列为中品。具有清热解毒的功效，用于热毒疮痈，咽喉肿痛，皮肤痒疹等。白英是茄科植物白英 solanum lyratumthunb.的干燥全草，具有清热利湿、解毒消肿的功效，用于风热感冒、咳嗽等。二者别名均有“白毛藤”之称，现代药用较为混乱。

2、各省中药材标准或中药饮片炮制规范中，蜀羊泉检测方法为显微鉴别，白英与蜀羊泉均为全草给药，药材市场上均为干燥全草碎块，经加工处理后，外观和显微特征受到一定破坏，许多药材特征点消失或重合，因而从性状、显微角度无法鉴定准确基原。2020年版《中国药典》四部通则中药材dna条形码分子鉴定法指导原则项下的核糖体dna第二内部转录间隔区tis2-its3或叶绿体psba-trnh为引物的dna条形码技术可以从dna层面鉴别白英、蜀羊泉药材，但对于混合样品则不适用。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的无法准确的鉴别真伪等问题，本发明提供了一种鉴别蜀羊泉的引物探针组。

2、本发明还提供了上述引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，填补了该领域的技术空白，规范了蜀羊泉药材的市场秩序；本发明所提供的实时荧光pcr方法，与dna条形码技术相比较准确度更高，更快捷，无需一代测序，节约试验成本，其对于混合样品能快速准确的鉴别蜀羊泉。

3、本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

4、本发明提供了一种鉴别蜀羊泉的引物探针组，所述引物探针组为：

5、syq-f：5'- tataaaatcaaactcgaatactcaa -3'；

6、syq-r2：5'- agtattttattgacatagacttttt -3'；

7、syq-p：5'fam- aaatgcaggcaaataccctctcc -3'bhq1。

8、进一步的，所述引物探针组特异性识别的蜀羊泉的基因序列为：

9、cactgccttgatccacttggctacatccgccccctcgtctacttacagtccatttttacattatttaaattagaaaacaaaagagtaaagttcgaatatttctcttctttcttatttcaatgatattattatttcgattattatttcaaagaataagaatatgaagtaaaaattctattttttgtgaaatgaaataaaaaagatatagtaacattagcaacaagaggaacaagttatatttctacaattttcaataaatataaaatcaaactcgaatactcaatcatgaataaatgcaggcaaataccctctccttctttttctataatgtaaacaaaaaagtctatgtcaataaaatactaggaaattaataaagaaaaagaaaaaaagaaaggagcaatagcaccctcttgatagaacaagaaaatggttattgctcctttcttttcaaaacctcctatagactaggctcggatcttatccatttgtagatggagcttcgatagcagctaggtctagagggaag。

10、本发明还提供了一种含有上述鉴别蜀羊泉的引物探针组的检测试剂盒。

11、本发明的另一目的为提供了一种上述鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，包括以下步骤：

12、（1）提取待测样品的模板dna；

13、（2）pcr反应体系配制：荧光pcr反应混合液，探针，上下游引物，供试品溶液，灭菌超纯水；

14、（3）对照反应体系为用等体积对照药材溶液代替供试品溶液的反应体系；空白对照反应体系为用等体积灭菌超纯水代替供试品溶液的反应体系；供试品及对照均设二个重复，ct值取二个重复的平均值作为最终结果；

15、（4）进行pcr反应，进行定性检测。

16、进一步的，步骤（2）中，所述pcr反应体系具体为：总体积为20µl，分别加入荧光pcr反应混合液（2×）10µl，探针（2.5µmol/l）1µl，上下游引物（5µmol/l）各1µl，供试品溶液1µl，灭菌超纯水6µl。

17、进一步的，步骤（3）中，所述对照反应体系包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为蜀羊泉药材；所述阴性对照为白英对照药材。

18、本发明提供的鉴别方法，所述pcr反应的参数为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，62℃，35秒，40个循环。

19、进一步的，鉴别过程中的判定原则为：白英无荧光对数增长，蜀羊泉有荧光对数增长，且相应的ct值＜32.0。

20、本发明的有益效果为：本发明以蜀羊泉为研究对象，以白英、蜀羊泉的叶绿体基因序列为基础，研究找出蜀羊泉的特异性引物及探针，将引物、探针及荧光pcr方法应用蜀羊泉药材中，该方法快捷、准确、有效、安全，能够实现对蜀羊泉药材的定性检测。

技术特征：

1.一种鉴别蜀羊泉的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组为：

2.根据权利要求1所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组特异性识别的蜀羊泉的基因序列为：

3.一种含有如权利要求1所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组的检测试剂盒。

4.一种权利要求1所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，其特征在于，步骤（2）中，所述pcr反应体系具体为：总体积为20µl，分别加入荧光pcr反应混合液10µl，浓度为2.5µmol/l的探针1µl，浓度为5µmol/l的上下游引物各1µl，供试品溶液1µl，灭菌超纯水6µl。

6.根据权利要求4所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，其特征在于，步骤（3）中，所述对照反应体系包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为蜀羊泉药材；所述阴性对照为白英对照药材。

7.根据权利要求4所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，其特征在于，所述pcr反应的参数为：阶段1：95℃，3分钟；阶段2：95℃，10秒，62℃，35秒，40个循环。

8.根据权利要求4-7任一项所述的鉴别蜀羊泉的引物探针组用于实时鉴别蜀羊泉的荧光pcr方法，其特征在于，鉴别过程中的判定原则为：白英无荧光对数增长，蜀羊泉有荧光对数增长，且相应的ct值＜32.0。

技术总结
本发明属于药材鉴定领域，具体涉及一种鉴别蜀羊泉的引物探针组及实时荧光PCR鉴别方法。本发明以蜀羊泉为研究对象，以蜀羊泉、白英及常见混淆品的叶绿体基因序列为基础，研究找出蜀羊泉的特异性引物及探针，将引物、探针及荧光PCR方法应用蜀羊泉药材中，从DNA层面鉴别蜀羊泉药材，该方法快捷、准确、有效、安全，能够实现对蜀羊泉药材的定性检测。

技术研发人员：解盈盈,汪冰,林永强,王晓彤,崔伟亮,刘洪超,栾永福,梅桂雪
受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15