一种用于在棉铃虫体内验证目的基因生物功能的系统及其应用

本发明涉及生物技术，涉及一种用于在棉铃虫体内验证目的基因生物功能的系统及其应用。

背景技术：

0、技术背景

1、田间害虫抗药性的迅速发展，是当今农业面临的主要威胁之一。棉铃虫是迄今为止世界上抗药性报道最多的害虫之一，对拟除虫菊酯、有机磷、氨基甲酸酯、有机氯和大环内酯等超过二十种杀虫剂产生了抗性。该昆虫在世界范围内分布广泛，具有高度的多食性，寄主植物超过300种，是棉花上的重要害虫之一，接近30％的市售杀虫剂用于控制棉铃虫。此外，棉铃虫是转基因棉花的靶标害虫，转基因棉花的大面积推广使我国以及世界多地的田间棉铃虫种群得到了有效的控制，但田间调查发现，即使推广转基因棉花数十年以后，我国田间棉铃虫仍然保持有对拟除虫菊酯类等多种杀虫剂的高水平抗药性。棉铃虫抗药性治理形势依旧十分严峻，但抗性分子机制的研究目前仍然缺乏深入研究，这对延续杀虫剂抗性的发展和杀虫剂的使用寿命，以及新型杀虫剂的研发十分不利。

2、目前大量研究发现，棉铃虫对多种杀虫剂的抗性主要是由细胞色素p450单加氧酶介导的。细胞色素p450单加氧酶(以下简称p450)是存在于所有昆虫体内的一类氧化酶，对异源化合物特别是杀虫剂具有解毒代谢能力，是昆虫体内的主要代谢酶。现有的功能研究证据表明，棉铃虫p450具有广泛的底物代谢谱，多个p450可以代谢同一种化合物，同时，一个p450也可以解毒不同结构类型的化合物，解毒代谢类的p450主要集中于cyp6和cyp9等亚家族中。此外，p450转录水平提升介导的解毒代谢能力增强是导致亚洲、非洲等多地棉铃虫田间种群产生多类杀虫剂抗性的主要分子机制。但是，由于棉铃虫体内p450基因数量超过140个，明确介导抗性演化的关键p450仍极具挑战。

3、根据p450介导解毒和杀虫剂抗性的分子机制特点，体内的过表达是最佳的功能验证手段，然而当前昆虫p450基因功能的研究主要采用体外功能表达，该方法并不能完全体现其在体内对解毒的贡献，而体内功能研究仍十分困难。目前在昆虫体内验证基因功能的手段主要有rna干扰(rna interference，简称rnai)、基于crispr-cas9的基因敲除和敲入技术以及基于gal4-uas系统的转基因果蝇技术，但在p450基因功能验证过程中均存在弊端。昆虫rnai主要通过将外源性的双链rna通过微量注射或者饲喂的方法递送至昆虫体内，通过内吞进入细胞后，被细胞质中的rnase-iii酶dicer加工成20-25bp长度的sirna，从而诱导后续内源性mrna的降解，达到降低目标基因转录和表达水平的目的。然而，以棉铃虫为代表的鳞翅目昆虫体内存在一到多个高效dsrna酶，可以直接将摄入的dsrna降解，从而阻断了sirna的加工，导致rnai在鳞翅目昆虫体内效率十分低下和不稳定，无法获得可靠的结果。此外，近些年新兴的crispr-cas9基因编辑技术在棉铃虫等鳞翅目昆虫的体内基因功能验证过程中发挥了重要作用，该技术将可以识别靶标序列的引导rna(grna)和可以切割dna的cas9蛋白进行结合后，通过显微注射导入昆虫胚胎，对靶向基因进行定点切割，造成基因的双链断裂。之后再利用生物体内原有的dna断裂修复机制，实现对目标基因的序列操纵：1、非同源末端链接(nhej)修复机制：在切割位点附近随机插入、缺失或替换碱基使目的基因发生移码突变，从而丧失功能，进而实现对基因的敲除；2、同源重组(hdr)修复机制，在提供外源同源重组模板的情况下，该机制能够实现靶基因的精准修复，从而实现对关键位点的替换或序列插入。crispr-cas9技术在棉铃虫体内进行基因敲除的效率较高，已有广泛报道，但无法对同时具有关键生理功能的p450基因进行体内敲除。此外，关键基因本底表达量较低以及基因补偿效应也会导致敲除个体无法表现出理想的表型。另外，使用crispr-cas9技术在棉铃虫体内进行基因敲入的效率较低，且仅局限于小片段(10bp以内)的修复或者碱基替换，对大片段(>100bp)的操纵仍十分困难。因此目前该技术更适合于对棉铃虫靶标基因进行基因敲除的研究，不适合进行基因敲入和过表达的研究。与之相比，基于gal4-uas系统的转基因果蝇技术是目前应用最多的异源体内过表达手段，但大量的研究表明，利用果蝇来过表达其他物种的p450基因时，一方面可能影响果蝇自身的生长发育，从而无法获得转基因品系，另外一方面，由于细胞环境的不同，过表达异源p450基因的果蝇对杀虫剂的敏感性并没有理想中的显著变化，甚至没有任何表型。

4、所以，基于piggybac转座子的转基因过表达技术为抗性基因的预测和抗性分子机制的研究提供了一条十分理想的方案。该技术利用piggybac转座子在昆虫体内将目标基因连同高效转座子等元件插入昆虫基因组dna，从而实现将目标基因敲入宿主体内并过量表达该基因，之后利用生物测定实验并结合一系列分子生物学技术，可以对目标基因功能进行鉴定。该技术方案的优点不仅在于能够实现将外源长片段基因敲入宿主昆虫基因组，也可以在原宿主昆虫的体内，以最合适的细胞环境来过表达验证目标基因的功能，然而，该方法在鳞翅目昆虫中的研究长期局限于模式昆虫家蚕，近期已在草地贪夜蛾这个非模式物种中有研究和报道，但是在棉铃虫中尚未有报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术中棉铃虫体内目的基因尤其是p450基因功能鉴定和预测方法的不足，提供一种用于在棉铃虫体内验证目的基因生物功能的系统。

2、本发明的另一目的是提供该系统的应用。

3、本发明的又一目的是提供一种构建过表达目的基因的转基因棉铃虫的方法。

4、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

5、一种用于在棉铃虫体内验证目的基因生物功能的系统，由以下组分组成：

6、(1)piggybac转座酶的mrna；

7、(2)过表达目的基因的piggybac转座质粒；所述的过表达目的基因的piggybac转座质粒包含piggybacl和piggybacr左右两个转座酶能够识别的反向末端重复序列，egfp标记基因表达盒，目的基因的表达盒以及增强子hr5；所述的egfp标记基因表达盒包括：ie1启动子、egfp基因的orf和sv40终止子；所述的目的基因的表达盒包括ie1启动子，目的基因的orf和sv40终止子。

8、作为本发明的一种优选，合成所述的piggybac转座酶的mrna的dna模板序列如seqid no.1所示。

9、作为本发明的一种优选，所述的piggybac转座酶的mrna通过体外转录获得：使用mmessage mmachine kit试剂盒对piggybac转座酶的dna模板进行体外转录，主要包括piggybac转座酶的dna模板的人工合成，体外转录体系的组装：10μl体系中包含t72×ntp/arca 5μl，10×t7 reaction buffer 1μl，dna模板1μg，t7 enzyme mix 1μl，孵育条件为37℃2-4小时，再使用酚氯仿对mrna产物进行纯化。

10、作为本发明的一种优选，所述的过表达目的基因的piggybac转座质粒通过以下方法制备得到：对piggybac背景质粒pbac[ie1-egfp-ie1-cas9-sv40](刘群.家蚕嗅觉相关基因的功能研究[d].导师：郝德君；黄勇平.南京林业大学,2019.)进行改造，使用aatⅱ和apaⅰ内切酶将该质粒线性化，再通过同源重组的方式将目的基因orf克隆至该质粒中构建过表达目的基因的piggybac转座质粒。

11、本发明所述的用于在棉铃虫体内验证目的基因生物功能的系统的以下任意一种或两种应用：

12、(1)构建过表达目的基因的转基因棉铃虫；

13、(2)在棉铃虫体内验证目的基因生物功能。

14、一种用于在棉铃虫体内验证p450基因对杀虫剂抗性的系统，由以下组分组成：

15、(1)所述的piggybac转座酶的mrna；

16、(2)所述的过表达目的基因的piggybac转座质粒，所述的目的基因为p450基因。

17、用于在棉铃虫体内验证p450基因对杀虫剂抗性的系统的以下任意一种或两种应用：

18、(1)构建过表达p450基因的转基因棉铃虫；

19、(2)在棉铃虫体内验证p450基因生物功能。

20、一种构建过表达目的基因棉铃虫的方法，包括通过显微注射的方法将所述的piggybac转座酶的mrna和过表达目的基因的piggybac转座质粒一同注射入棉铃虫新鲜胚胎中的方式来构建转基因棉铃虫。

21、作为本发明的一种优选，所述的方法中使用显微注射仪将piggybac转座酶的mrna和转座质粒一同注射入棉铃虫的新鲜胚胎，获得g0代转基因棉铃虫；将g0代转基因棉铃虫成虫群交，获得g1代的转基因棉铃虫后，收集所有g1代初孵幼虫，用荧光显微镜从中筛选具有egfp信号的个体，获得阳性转基因棉铃虫个体；将阳性棉铃虫转基因个体与背景品系回交后扩大种群数量，从而获得稳定的转基因棉铃虫种群来获得转基因棉铃虫品系。

22、一种用于鉴定棉铃虫或其近缘害虫体内细胞色素p450基因功能的方法，按照所述的方法构建过表达p450基因棉铃虫，通过农药生物测定的方法检测转基因棉铃虫对农药的敏感性变化水平来鉴定该p450基因的功能。

23、作为本发明的一种优选，所述的农药生物测定的方法为：使用涂表法进行生物测定：用含有0.1％triton x-100的蒸馏水将配制的杀虫剂稀释以产生五至七个系列浓度，对照组仅用0.1％triton x-100溶液处理，将100μl杀虫剂溶液喷在24孔板的饲料表面上，待溶液在室温下干燥后，将一头二龄初的幼虫放入孔中，每个浓度测试48头幼虫，3天后检查幼虫的死亡率，如果幼虫无法正常移动，则认为它已经死亡，通过poloplus程序计算lc50值和95％的置信区间，如果两个lc50的95％置信区间不重叠，则认为这两个lc50值存在显著性差异，通过对比转基因棉铃虫和其背景品系的lc50值来判断转基因棉铃虫对农药敏感性水平的变化，从而鉴定p450基因的功能。

24、本发明涉及的合称piggybac转座酶mrna的dna模板序列参考chen&palli(2021)，并通过棉铃虫密码子偏好性优化后直接进行基因合成(seq id no.1)；原始的piggybac转座质粒(pbac[ie1-egfp-ie1-cas9-sv40])是由江苏科技大学生命科学院谭安江老师馈赠，参考(刘群.家蚕嗅觉相关基因的功能研究[d].导师：郝德君；黄勇平.南京林业大学,2019.)，我们通过双酶切的方式将该质粒线性化后，再通过同源重组的方式将目的基因p450的orf克隆至该载体，构建为我们所需的piggybac转座质粒(pbac:hr5ie1-egfp-sv40:ie1-p450-sv40)(附图1)。

25、有益效果

26、本发明主要通过显微注射的方式将piggybac转座酶的mrna和转座质粒一同注射入棉铃虫的新鲜胚胎中，其中，转座质粒中不仅包含目的基因(p450基因)表达盒，也包含标记基因(egfp)表达盒，所以，本发明通过筛选后代中具有egfp荧光信号的幼虫，来构建转基因棉铃虫品系。

27、本发明与现有的昆虫p450基因功能和抗性基因预测研究相比，其优点和积极效果表现在：(1)成本更低：离体功能鉴定需要用到细胞培养室、超速离心机、液质联用仪器等高值仪器，购买和使用费用高昂。本技术利用过表达p450基因的转基因棉铃虫品系进行生物测定，通过分析与背景品系的表型差异，可以高通量低成本地筛选目标p450基因与化合物解毒之间的关系。(2)附加值更高：本技术制定的转基因棉铃虫品系构建和生物测定相结合的策略，不仅可以对基因功能进行鉴定，还可以对抗性演化的分子机制以及杀虫剂先导化合物的筛选提供支持。(3)相比于体外功能鉴定和基于转基因果蝇的功能鉴定，该结果更为准确：在转基因棉铃虫体内验证近缘物种基因或者棉铃虫内源基因时，昆虫体内环境和细胞环境等变量对实验结果的影响较小，从而可以更为准确地对基因功能进行鉴定，获得更准确的表型。此外，与棉铃虫进化关系接近的重大害虫较多，转基因棉铃虫的构建将有益于多个近缘害虫基因功能和抗性机制的研究。