鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.4亚系的引物和探针组合物、试剂盒和应用的制作方法

本发明是关于鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物、探针及其应用，更具体地说是关于针对新型冠状病毒omicron株ba.4亚系orf1a基因δ141-143突变位点的引物、探针、试剂盒和检测方法，属于分子生物学检测。

背景技术：

1、由新型冠状病毒(sars-cov-2)引起的新型冠状病毒感染(covid-19)严重危害了全球公共卫生安全和人民的生命健康。新冠病毒的基因组与其它病毒相比极易发生突变，导致该病毒的传播能力和致病性增强，并且降低现有疫苗的保护效果。omicron变异株出现后，成为全球主要流行毒株，被who评为第五种“关切变异株”(variants of concern，voc)。该毒株在短短一年多的时间内发生了多次变异，据covariants网站统计，目前已有11种亚系，分别是ba.1、ba.2、ba.3、ba.4、ba.5、ba.2.12.1、ba.2.75、bq.1、xbb、xbb.1.5、xbb.1.16。对新冠流行毒株的密切监测有利于疫情的精准防控。自疫情以来，我们致力于开发能够快速、准确鉴别新冠流行毒株的方法，目前已经成功开发了鉴别ba.1亚系(专利号cn114561497b)和ba.3亚系(专利号cn114592097b)的方法。本发明主要为一种快速、准确鉴别ba.4亚系的qpcr方法。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供两种用于鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物探针组合。

2、本发明的另一目的在于提供一种用于鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的试剂盒。

3、本发明的另一目的在于提供所述引物、探针或试剂盒用于鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的相关应用。

4、本发明提供的第一种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物和探针的组合物，其包括如seq id no.1所示序列的上游引物，如seq id no.2所示序列的下游引物，如seq id no.3所示序列的探针：

5、5’- taagaacggtaataaaggagctg -3’(seq id no.1)；

6、5’- gaaaatcttcataaggatcagtgc -3’ (seq id no.2)；

7、5’- ccgatctagacttaggc -3’ (seq id no.3)。

8、本发明提供的第二种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物和探针的组合物，其包括如seq id no.4所示序列的上游引物，如seq id no.5所示序列的下游引物，如seq id no.6所示序列的探针：

9、5’- gaacggtaataaaggagctggtg -3’(seq id no.4)；

10、5’- gaaaatcttcataaggatcagtgcc -3’ (seq id no.5)；

11、5’- gccgatctagacttaggcg -3’ (seq id no.6)。

12、根据本发明的具体实施方式，所述探针可以是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：

13、探针序列5’端碱基采用荧光报告基团修饰，同时探针序列3’端碱基采用荧光淬灭基团修饰。

14、另一方面，本发明还提供了两种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的试剂盒，其包含：本发明所述的第一种引物和探针的组合物，和/或本发明所述的第二种引物和探针的组合物。

15、根据本发明的具体实施方式，本发明的试剂盒，其中还包括pcr反应试剂和/或反应缓冲液。

16、根据本发明的具体实施方式，本发明的试剂盒，其中还包括阳性质控品；优选地，所述阳性质控品包括新型冠状病毒omicron株ba.4亚系orf1a基因部分序列的标准质粒模板。

17、另一方面，本发明还提供了所述的两种引物和探针的组合物或所述的试剂盒在体外鉴别样品中是否存在新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的非诊断目的应用。即，本发明还提供了两种体外鉴别样品中是否存在新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的方法。

18、根据本发明的具体实施方式，本发明的应用中，通过pcr反应鉴别样品中是否存在新型冠状病毒omicron株ba.4亚系，所述引物中每一条在pcr反应体系中的终浓度为1-10μm，所述探针在pcr反应体系中的终浓度为1-10μm。

19、根据本发明的具体实施方式，本发明的应用中，所述pcr可以为单重pcr、多重pcr、数字pcr或rt-pcr。

20、在本发明的一些具体实施方式中，本发明的应用中，所述pcr为单重探针qpcr，其中当两种实施方式中的扩增曲线为s型曲线时，可鉴定为新型冠状病毒omicron株ba.4亚系阳性。

21、在本发明的一些具体实施方式中，本发明的鉴别应用方法包括以下步骤：

22、s1：提取待测样品rna，将rna反转录成cdna；

23、s2：配制反应体系：将1-10μm范围内的任何一个浓度的上游引物、下游引物和探针加入到体系中，加入1pg-1μg范围内的任何一个浓度的样本cdna，加入商业化qpcr预混酶，最后用ddh2o调节反应体系总体积到10-20 μl范围内的任何一个体积；

24、s3：设定反应条件：根据所使用qpcr预混酶设定反应条件；

25、s4：结果分析：根据探针所标记的荧光基团选择仪器上相应的波长通道进行分析并记录结果。

26、本发明针对omicron株ba.4亚系orf1a基因δ141-143位点设计了引物和探针。扩增结果中扩增曲线为典型的“s型”曲线，则为阳性结果；扩增结果中扩增曲线不是典型的“s型”曲线，则为阴性结果。

27、有益效果：

28、本发明具有成本低、操作简便、对仪器设备要求低、检测周期短、结果准确可靠等优点。本发明所述的鉴别应用可以为非诊断目的的，或是诊断目的的。非诊断目的的应用例如可包括应用于新型冠状灭活疫苗生产中对毒种的快速鉴别，同时适用于对灭活后的新型冠状病毒原液的鉴别。此外，本发明可应用于新型冠状病毒核酸筛查过程中对omicron株ba.4亚系的鉴别，待鉴别的样品可以是来自人或动物的离体样品，也可以是来自非宿主的环境样品。本发明的推广使用将会给疫苗生产过程中的检测人员、科研工作者以及医务工作者节约大量时间和经费。

技术特征：

1. 一种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物和探针的组合物，其特征在于，所述引物包括seq id no.1所示序列的上游引物和seq id no.2所示序列的下游引物，所述探针包括seq id no.3所示序列的探针：

2. 一种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的引物和探针的组合物，其特征在于，所述引物包括seq id no.4所示序列的上游引物和seq id no.5所示序列的下游引物，所述探针包括seq id no.6所示序列的探针：

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述探针是经荧光基团修饰的，所述修饰包括：

4.一种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求1所述的引物和探针的组合物。

5.一种鉴别新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：权利要求2所述的引物和探针的组合物。

6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应试剂和/或反应缓冲液。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品；所述阳性质控品包括新型冠状病毒omicron株ba.4亚系orf1a部分基因序列的标准质粒模板。

8.权利要求1-3中任一项所述的引物和探针的组合物或权利要求4-7中任一项所述的试剂盒在体外鉴别样品中是否存在新型冠状病毒omicron株ba.4亚系的应用，所述应用为非诊断目的。

9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过qpcr反应鉴别样品中是否存在新型冠状病毒omicron株ba.4亚系，所述引物中每一条在qpcr反应体系中的终浓度为1μm -10μm，所述探针在qpcr反应体系中的终浓度为1μm -10μm。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述qpcr为单重pcr、多重pcr、数字pcr或rt-pcr。

11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述qpcr为单重探针qpcr，其中当权利要求1或权利要求2所述的组合物中的所述引物和探针的扩增曲线为s型曲线时，鉴定为新型冠状病毒omicron株ba.4亚系阳性。

技术总结
本发明提供了鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.4亚系的引物和探针组合物、试剂盒和应用。筛选获得两种灵敏度高、特异性强的引物‑探针组合物。第一种引物和探针的组合物包括如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.3所示序列的探针。第二种组合物包括如SEQ ID NO.4所示序列的上游引物，如SEQ ID NO.5所示序列的下游引物，如SEQ ID NO.6所示序列的探针。利用本发明的两种引物探针组合，均可通过qPCR方法鉴别新型冠状病毒Omicron株BA.4亚系。

技术研发人员：张云涛,王展慧,赵玉秀,张晓楠,郭彦岑,何振玉,贺瑶
受保护的技术使用者：北京生物制品研究所有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15