一种具有抗血栓活性的汉麻仁多肽序列的筛选方法

本发明属于功能食品领域，具体涉及一种具有抗血栓活性的汉麻仁多肽序列的筛选方法。

背景技术：

1、血栓的形成在各种心血管疾病的发病机理中起关键作用，血栓类疾病严重威胁着人类的健康[1]。据统计，血栓导致的死亡已达全球总死亡人数的51％，远高于肿瘤及其他疾病的死亡率，是目前国家重点监控防治的一类疾病。

2、特别是在新冠病毒出现以来，起初被认为主要引起肺炎和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ards)等呼吸道相关临床特征的covid-19[2]，被越来越多的研究发现与静脉、动脉和微血管血栓形成的血栓前状态密切相关。尸检研究表明，静脉血栓栓塞可能是导致covid-19重症患者死亡的主要原因[3]。因此，血栓的预防和治疗已成为当今学界一大热点问题。由于目前临床上传统的抗血小板药物和抗凝药物仍存在出血事件、药效不够、选择性差等弊端，因而高效且副作用小的抗血栓药物及其预防和治疗作用机制成为学者们研究的重点。目前常采用合成方法或从生物中提取两种手段获得抗血栓肽，合成方法得到的抗血栓肽成本高，不利于临床应用，生物提取的抗血栓肽源多为毒蛇、蜈蚣、水蛭等有安全性问题的生物，获得的抗血栓肽易携带本身具有的副作用。而在大健康、治未病时代来临之际，采用食源性原料获取抗血栓活性肽，无毒害作用，安全性高，在人的肠胃内很快被消化吸收，进而在人体的抗血栓系统中发挥作用。

3、汉麻又称火麻，作为高生态性且具有特殊作用的经济作物，于2002年被列入药食同源目录，成为药食两用的功能性食品原料。我国对汉麻仁的研究较早，李时珍在《本草纲目》中对汉麻仁的医用价值有记载，称其能“补中益气，久服肥健不老”，“去风痹皮顽，令人心欢，利大肠、风热结燥”，“破积血，复血脉，去乳妇产后余疾，取汁煮粥食，止呃逆”等。现代医学研究表明，汉麻仁有较好的降血压、利尿、镇痛、抗炎、预防血栓形成的作用，长期食用，对慢性神经炎、瘫痪、便秘、高血压、高血脂、溃疡以及妇科疾病具有很好的辅助疗效[4]。丛涛[5]等研究了汉麻仁对生长期大鼠营养生理功能的影响，发现服用汉麻蛋白质的大鼠血清总蛋白显著降低，但血清白蛋白占比最高，达78.2％，血清白蛋白具有抑制血小板聚集、抗凝血以及提高免疫力的生理功能。通过本课题组多年对汉麻仁蛋白提取物的细胞学及小鼠试验研究中也发现汉麻仁含有抗肝癌、抗炎、抗菌以及促重金属代谢的多种肽[6,7]。传统的食源性生物活性肽的主要筛选鉴定方法为：选定目标蛋白、蛋白水解、分离或纯化水解产物或者单个肽段、活性测定及验证肽的活性。在此过程中，蛋白分离纯化将会耗费大量的样品和纯化时间，且结果不能得到保障；每次纯化的数量有限，分离之后收集的样品经各种浓缩干燥等过程，会造成大量的损失。同时传统的食药体内试验常采用小鼠、大鼠、豚鼠等作为模型生物。虽然稳定性好，但是试验周期长、活性物质消耗量大，试验成本非常高。

4、[1]马广大.心血管疾病急诊患者的临床特点分析及临床治疗对策[j].世界最新医学信息文摘,2019,19(56):46-47.

5、[2]ahmed s,zimba o,gasparyan a y.thrombosis in coronavirus disease2019(covid-19)through the prism of virchow's triad[j].clin rheumatol,2020,39(9):2529-2543.

6、[3]zhou p,yang x l,wang x g,et al.a pneumonia outbreak associatedwith a new coronavirus of probable bat origin[j].nature,2020,579(7798):270-273.

7、[4]宋淑敏,刘宇峰,董艳等.汉麻籽的营养价值及开发利用[j].农产品加工,2016,(9):54-55.

8、[5]丛涛,江雪媛,赵霖等.火麻仁蛋白质粉对生长期大鼠营养生理功能的影响研究[j].中国食品学报,2011,11(02):60-69.

9、[6]魏连会,董艳,石杰等.汉麻籽粕酶解物中抗肝癌hep3b细胞活性肽的分离与鉴定[j].中国粮油学报,2022,37(03):74-78.

10、[7]魏连会,宋淑敏,董艳等.汉麻籽多肽的氨基酸营养组成与体外结合胆酸盐能力的研究[j].中国粮油学报,2020,35(01):62-66.

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种具有抗血栓活性的汉麻仁多肽序列的筛选方法，同时为筛选的汉麻仁蛋白提供一种新的应用方式，提供一种血栓类疾病预防和治疗的一种安全的途径。

2、本发明以汉麻仁蛋白为原料，以优化的酶解工艺进行生物转化获得混合汉麻仁抗血栓肽；通过动态错流浓缩膜过滤技术纯化得到了分子量在3000da以下的汉麻仁抗血栓肽，并进行肽段鉴定，获得了1749个多肽序列；采用分子对接等生物信息学手段预测筛选出了具有高抗血栓活性的汉麻肽(结合能打分绝对值>100分)序列103个，优选了8个进行生物合成，并验证其体外凝血酶抑制活性；选择凝血酶抑制活性最好的一个多肽序列(derqreieqerr)进行了斑马鱼血栓模型试验，验证了其体内抗血栓活性。

3、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

4、一种具有抗血栓活性的汉麻仁多肽序列的筛选方法，所述方法为：

5、步骤一：酶解：以汉麻仁蛋白为原料，以凝血酶抑制率为指标，筛选最优酶、优化酶解最佳工艺条件，得到凝血酶抑制活性最高的酶解液；

6、步骤二：鉴定酶解肽序列：将步骤一中的酶解液逐级分离纯化，得到凝血酶抑制活性最高的分子量段进行多肽序列鉴定；

7、步骤三：分子对接：获得的序列通过与凝血酶进行柔性配体对接，进行计算，得到多肽序列与凝血酶底物结合打分；

8、步骤四：选定几种进行体外验证：结合分子对接打分、多肽序列鉴定打分、丰度及氨基酸数量进行筛选，选择8个多肽序列进行了生物合成，采用凝血酶抑制率的试验进行验证，检测这8个序列是否具有凝血酶抑制活性，若有，则进行步骤五，若没有，则结合打分高的重新选择多肽序列进行生物合成；

9、步骤五：体内验证：选择验证后凝血酶抑制活性最高的多肽序列进行生物固相合成，进行斑马鱼体内抗血栓试验，验证其在体内是否具有抗血栓活性，若有，则成功筛选得到具有抗血栓活性的汉麻仁多肽序列，若没有，则返回步骤四，结合打分高的重新选择多肽序列进行生物合成。

10、进一步地，所述方法为：

11、步骤一：以汉麻仁蛋白为原料，以优化的酶解工艺进行生物转化获得混合汉麻仁抗血栓肽；

12、步骤二：通过动态错流浓缩膜过滤技术纯化得到了分子量在3000da以下的汉麻仁抗血栓肽，并进行肽段鉴定，获得了1749个多肽序列；

13、步骤三：采用分子对接生物信息学手段预测筛选出了具有高抗血栓活性的汉麻肽序列103个；

14、步骤四：结合分子对接打分、多肽序列鉴定打分、丰度及氨基酸数量进行筛选，从103个汉麻肽序列中优选了8个进行生物合成，并通过体外凝血酶抑制活性从这8个中筛选出最优的；(筛选标准：根据①分子对接结合能打分情况(绝对值高于100)；②液质连用多肽序列鉴定打分情况(高于100)；③液质连用多肽序列鉴定的丰度(大于1*107))；

15、步骤五：体内验证：选择验证后凝血酶抑制活性最高的多肽序列进行生物固相合成，进行斑马鱼体内抗血栓试验，验证其在体内的抗血栓活性。

16、进一步地，步骤一中，酶解工艺条件为温度37-50℃，料液比1：16-40，酶添加量1％-7％，ph7.0-8.5。

17、进一步地，步骤一中，酶解工艺条件为温度40℃，料液比1:25，酶添加量5.68％，ph8.0。

18、一种上述筛选方法得到的汉麻仁多肽序列在制备抗血栓药物中的应用。

19、本发明相对于现有技术的有益效果为：本发明采用药食同源的汉麻仁获取抗血栓活性肽，无毒害作用，安全性高，在人的肠胃内很快被消化吸收，进而在人体的抗血栓系统中发挥作用。本发明中体内验证采用的是斑马鱼试验，它为抗血栓活性食药的研究提供了周期更短、观察更直观、用样量更少、可行性更高的体内研究评价手段。