一种永生化细胞系及其构建方法和应用与流程

本技术属于干细胞及细胞培养肉，具体涉及一种永生化细胞系及其构建方法和应用。

背景技术：

1、肌肉干细胞又称为卫星细胞(satellite cells，scs)，具有自我更新和分化为成熟肌肉细胞的能力，是肌肉再生的具体执行者。肌肉干细胞通常保持静息状态，而当肌肉受到损伤等外界刺激时，肌肉干细胞能够迅速响应环境改变进入激活状态，并分化为有功能的肌肉细胞，进而修复损伤部位。培养肉就是依据这种修复机制，在体外培养肌肉干细胞从而获得的肉类。培养肉，又称细胞培养肉、清洁肉、人造肉等，是根据肌肉组织的生长发育特点及损伤修复机理，在体外分离、培养并诱导分化种子细胞以获得肌纤维、胶原蛋白和/或脂肪等，再经食品加工、塑性等过程制备而成的可以食用的肉制品。与传统养殖方式相比，细胞培养肉的生产过程不涉及大批量养殖和屠宰，生产方式也更加安全，因此在动物福利、食品安全和环境保护方面有独特优势。

2、种子细胞是培养肉生产的关键材料，合适的种子细胞需要具备高效的增殖能力及分化能力，但一般细胞在长期培养过程中其增殖能力会逐渐减弱，主要原因是染色体端粒随着dna的复制而缩短，反复缩短使端粒受到损伤，从而使细胞进入衰老状态。原代细胞经历有限数量的分裂即到达衰老阶段，只能短暂的用于培养肉生产，这使得培养肉的工业化规模生产变得困难。因此，进行原代细胞永生化的研究变得尤为重要。

3、细胞永生化，是指在体外培养的细胞自发或者受到外界因素影响后逃离衰老等因素导致的增殖抑制，从而能够无限增殖。永生化细胞比原代细胞生长更加强劲、更易于培养，而且其稳定均一、性状一致。目前报道的针对肌肉干细胞的永生化主要集中在使其在体外获得长期传代的能力，但其分化能力是否提高鲜有报道。然而，细胞增殖能力和分化潜能是种子细胞应用在培养肉上非常重要的两个方面。

4、p14arf和p16 ink4a(p16)是一种重要的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ckis)，在哺乳动物中由cdkn2a基因编码。细胞周期从一个阶段到另一个阶段的进展主要由细胞周期蛋白控制。细胞周期蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶(cdks)的辅因子，细胞周期蛋白与cdks结合并激活它们，从而增强细胞周期进程。而p16通过抑制cdks进而抑制和调节细胞周期进程。作为一种细胞周期抑制基因抑制因子，研究表明p16缺失会促进细胞增殖，诱导细胞永生化。例如，使cdkn2a位点失活并同时异位表达htert可建立永生化的前列腺上皮细胞系。此外，通过hpv-16e7灭活p16 ink4a/prb通路或下调p16 ink4a表达并激活端粒酶可使细胞永生化。但是这种永生化的方法往往需要结合其他外源基因的表达或者病毒基因的引入，存在基因安全风险。特别的，虽然已有研究证明通过cdkn2a基因敲除可实现细胞的永生化，但是cdkn2a基因敲除后往往会导致细胞分化潜能的丧失。因此通过p16敲除的方式构建猪肌肉干细胞永生化细胞系，在能够维持较好增殖的情况下是否能够同时维持较好的细胞分化特性仍未可知。

5、肌肉生长抑制素(myostatin，mstn)又称生长分化因子-8(gdf-8)，是tgf-β超家族的成员。mstn是肌肉生长的负调控因子，通过调控细胞周期抑制肌肉生长。mstn在g1期的表达量最高，可下调cdk2的表达水平，降低cyclin e和cdk2复合物的形成。也可以上调ckis活性和水平，阻碍myod丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化，使其不能释放g1期向s期的基本转录因子，抑制成肌细胞增殖，阻碍肌肉生成。此外通过受体介导的方式也可以抑制肌肉生长，如激活smad信号通路、激活mapks通路、抑制akt通路等。

技术实现思路

1、1.发明目的

2、本技术的目的是提供一种永生化细胞系及其构建方法和应用，尤其是猪肌肉干细胞永生化细胞系，包括利用crispr-cas9敲除技术构建cdkn2a基因单敲除及cdkn2a联合mstn基因双敲除的细胞系，并筛选出具有持续增殖能力的同时具有良好分化性能的优良细胞系，获得高增殖速率且维持细胞干性的永生化猪肌肉干细胞系，解决原代肌肉干细胞体外扩增过程中增殖能力下降和分化能力丧失或cdkn2a基因敲除导致细胞丧失分化潜能的问题，为培养肉产业化和工艺优化提供优质种子细胞资源。

3、2.技术方案

4、为了解决上述问题，本技术所采用的技术方案如下：

5、本技术提供了包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的grna：

6、cdkn2a grna-3 f1：5-caccgtcgtgtaccggtcgggtga-3(seq id no.7)；

7、cdkn2a grna-3 r1：5-aaactcacccgaccggtacacgac-3(seq id no.8)。

8、本技术还提供了上述grna在利用crispr-cas9系统敲低或敲除细胞中cdkn2a基因中的应用。

9、本技术还提供了包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列的grna：

10、mstn grna-3 f3：5-caccgtaggactacttacactctgt-3(seq id no.25)；

11、mstn grna-3 r3：5-aaacacagagtgtaagtagtcctac-3(seq id no.26)。

12、本技术还提供了上述grna在利用crispr-cas9系统敲低或敲除细胞中mstn基因中的应用。

13、本技术还提供了一种永生化细胞系的构建方法，包括降低或者消除原代细胞中p16蛋白的表达，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。

14、进一步地，上述一种永生化细胞系的构建方法，还包括同时降低或者消除细胞中mstn蛋白的表达，获得的永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。

15、进一步地，上述降低或者消除原代细胞中p16蛋白的表达包括敲低或敲除cdkn2a基因。

16、进一步地，cdkn2a基因如gene id:396553所示。

17、进一步地，上述降低或者消除细胞中mstn蛋白的表达包括敲低或敲除mstn基因。

18、进一步地，mstn基因如gene id:399534所示。

19、进一步地，上述敲低或敲除包括利用crispr/cas系统敲低或敲除cdkn2a基因和/或mstn基因。

20、进一步地，上述利用crispr/cas系统敲低或敲除cdkn2a基因和/或mstn基因包括设计靶向cdkn2a基因或mstn基因的grna，该grna能够与cdkn2a基因和/或mstn基因中靶序列互补。

21、进一步地，上述cdkn2a基因中的靶序列为cdkn2a基因的外显子2中的片段。更进一步地，上述cdkn2a基因中的靶序列为gtcgtgtaccggtcgggtga(seq id no.1)。

22、进一步地，上述mstn基因中的靶序列为mstn基因的外显子1中的片段。更进一步地，上述mstn基因中的靶序列为taggactacttacactctgtagg(seq id no.2)。

23、进一步地，上述crispr系统包括crispr-cas9系统或crispr-cas13系统。

24、进一步地，上述crispr系统包括crispr-cas9系统。

25、进一步地，上述利用crispr-cas9系统敲低或敲除cdkn2a基因中的grna包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：

26、cdkn2a grna-3 f1：5-caccgtcgtgtaccggtcgggtga-3(seq id no.7)；

27、cdkn2a grna-3 r1：5-aaactcacccgaccggtacacgac-3(seq id no.8)。

28、进一步地，上述利用crispr-cas9系统敲低或敲除mstn基因中的grna包括如下核苷酸序列或与如下核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的序列：

29、mstn grna-3 f3：5-caccgtaggactacttacactctgt-3(seq id no.25)；

30、mstn grna-3 r3：5-aaacacagagtgtaagtagtcctac-3(seq id no.26)。

31、进一步地，上述原代细胞包括肌肉干细胞、脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及经过修饰的肌肉干细胞、脂肪间充质干细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等细胞。

32、进一步地，上述原代细胞包括肌肉干细胞。

33、进一步地，上述肌肉干细胞包括来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽的肌肉干细胞。更进一步地，上述肌肉干细胞来源于猪，即猪肌肉干细胞。

34、本技术还提供了上述一种永生化细胞系的构建方法构建的永生化细胞系，该永生化细胞系提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。

35、本技术还提供了一种永生化细胞系，该永生化细胞系中p16蛋白降低或者消除表达，提高了细胞的增殖能力且不降低细胞的分化能力。

36、进一步地，上述一种永生化细胞系，还包括mstn蛋白降低或者消除表达。

37、进一步地，上述一种永生化细胞系，包括被破坏的cdkn2a基因和/或被破坏的mstn基因。

38、进一步地，上述被破坏的cdkn2a基因包括内源性cdkn2a基因的敲低或敲除。

39、进一步地，上述被破坏的mstn基因为内源性mstn基因的敲低或敲除。

40、进一步地，上述一种永生化细胞系包括肌肉干细胞永生化细胞系。

41、进一步地，上述肌肉干细胞包括来源于猪、牛、羊、鱼或其他家禽的肌肉干细胞。更进一步地，上述肌肉干细胞来源于猪，即猪肌肉干细胞。

42、本技术还提供了一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株sccdkn2a ko-15，于2022年12月7日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no:c2022371。

43、本技术还提供了一种猪肌肉干细胞永生化细胞系，命名为幼猪肌肉干细胞株sccdkn2a-mstn dko clone1，于2023年2月26日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为cctcc no:c202347。

44、本技术还提供了上述一种猪肌肉干细胞永生化细胞系在制备膳食消费品中的应用。

45、进一步地，上述膳食消费品包括细胞培养肉。

46、进一步地，上述应用包括在体外培养基中培养上述永生化细胞系，增殖、诱导分化后制备成细胞培养肉。

47、进一步地，上述应用中，体外培养基包括无血清培养基。

48、本技术还提供了一种细胞培养肉产品，包括上述永生化细胞系。

49、3.有益效果

50、本技术与现有技术相比，其有益效果在于：

51、(1)本技术提供的grna，能够针对性的与cdkn2a基因或mstn基因中靶序列互补，用于crispr-cas9系统敲低或敲除细胞中cdkn2a基因或mstn基因，用于构建高增殖速率和/或维持细胞干性的永生化细胞系。

52、(2)本技术提供的永生化细胞系的构建方法，首次使用crispr-cas系统在猪原代肌肉干细胞中敲除cdkn2a基因建立了永生化细胞系，并在已敲除cdkn2a基因的猪肌肉干细胞永生化细胞系上成功敲除了mstn基因，建立了cdkn2a联合mstn双敲除猪肌肉干细胞永生化细胞系，该方法操作简便，无外源基因插入，构建的细胞系在维持细胞高效增殖的同时也提高了分化潜能。

53、(3)本技术提供的猪肌肉干细胞永生化细胞系，无外源基因插入，在维持细胞高效增殖的同时也提高了分化潜能。除此之外，该细胞系在无血清增殖培养基和无血清分化培养基中能够维持较好的增殖及分化能力，可以利用完整的无血清培养基系统完成增殖和分化，克服了现有技术中在增殖和分化阶段需要至少一个含血清培养基的技术问题。该细胞系能够为培养肉生产的各种工艺参数研究提供工程化细胞，也能为培养肉生产贡献优良的细胞资源。