不产毒黄曲霉、所得生防菌剂及其应用

本发明属于微生物，涉及微生物筛选、发酵及其应用，具体涉及不产毒黄曲霉、生防菌剂及其在黄曲霉毒素防治方面的应用。

背景技术：

1、黄曲霉(aspergillus flavus)侵染农作物后能产生黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)等次生代谢产物，严重威胁消费安全和人民生命健康。其中，花生、玉米等经济作物易受黄曲霉侵染和黄曲霉毒素等真菌毒素污染。我国是农业大国，因此，研究农产品黄曲霉污染的田间防控，从源头降低黄曲霉侵染，对守护我国人民舌尖上的安全、提升我国农产品国际竞争力具有重要意义。

2、生物防控具有不破坏农产品原有品质，原料成本较低、一旦定植可长久影响菌落组成等优点，是黄曲霉及黄曲霉毒素绿色控制的有效途径。利用不产毒的黄曲霉菌来竞争抑制田间产毒黄曲霉菌生长、繁殖，从而减少产毒菌菌群数量，降低黄曲霉毒素污染水平，是源头控制花生、玉米等农产品中黄曲霉毒素污染非常有效的生物防治方法。目前，以不产毒黄曲霉作为生物防治菌株开发的菌剂已经在美国、非洲和意大利均有应用，而我国对不产毒黄曲霉生防菌的研究处在起步阶段，还没有在田间成功大规模应用的案例。

技术实现思路

1、本发明提供了一种不产毒黄曲霉、所得生防菌剂及其在黄曲霉毒素防治方面的应用，所述不产毒黄曲霉菌株是安全性高、竞争优势强的生防菌株，能显著抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染，可以单独或复配制成菌剂作为生物防治剂。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种不产毒黄曲霉，选自黄曲霉aspergillusflavus pa04、ca04、sz05、sf01中的至少一种；

3、所述sf01的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述pa04的核苷酸序列如seq idno：2所示，所述ca04的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述sz05的核苷酸序列如seq idno：4所示。

4、作为优选，所述sf01于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cctcc no.40823；

5、所述pa04于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cctcc no.40822；

6、所述ca04于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cctcc no.40821；

7、所述sz05于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cctcc no.40824。

8、作为优选，所述不产毒黄曲霉均不产黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒g2。

9、本发明提供了一种生防菌剂或玉米胚芽菌剂，采用上述任一项技术方案所述的不产毒黄曲霉单独或复配得到。

10、作为优选，通过以下方法制备得到：

11、制备浓度为108分生孢子/ml的不产毒黄曲霉的孢子悬浮液，将其接种于无菌大米中，充分混合均匀后，于30℃下培养5d，制成大米初发酵产物；

12、向大米初发酵产物中加入无菌0.5％tween-80溶液，涡旋，使黄曲霉孢子从大米上洗脱，收集洗脱液，并将其浓度调整至106分生孢子/ml；

13、将玉米胚芽装入全棉纱布袋中，封口，于121℃高压灭菌20min后，50℃干燥过夜，使水分含量降至8％以下，在无菌广口烧杯中将其与孢子悬浮液混合，使孢子充分附着在玉米胚芽上；

14、将成品放入全棉纱布袋中，于30℃培养2-3d，得到浓度为108分生孢子/ml的菌剂。

15、作为优选，在种子发芽后及开花前2-3周施用。

16、本发明提供了一种根据上述任一项技术方案所述的不产毒黄曲霉在竞争抑制黄曲霉菌产毒素中的应用。

17、本发明提供了一种显著降低农产品中黄曲霉毒素含量的方法，在农产品种子发芽后及开花前2-3周施用根据上述任一项技术方案所述的生防菌剂或玉米胚芽菌剂。

18、所述农产品为玉米、花生、小麦、辣椒、棉花、杏仁等。

19、与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

20、本发明提供了不产毒的黄曲霉(aspergillus flavus)pa04、ca04、sz05、sf01，所述黄曲霉的保藏编号分别为cgmcc no.40822、cgmcc no.40821、cgmcc no.40824、cgmccno.40823。本发明所述菌株能够竞争抑制产毒黄曲霉的生长和产毒，显著降低花生等农产品中黄曲霉毒素的含量，具有安全性高、繁殖力强、易定植的优势。

21、实验结果显示，本发明所述菌株对标准菌株nrrl 3357以及不同花生产地分离出来的产毒黄曲霉的黄曲霉毒素抑制效果好；pda培养基培养5天菌落直径为7.3±0.3cm，经tlc及hplc测定其产毒能力，结果均为不产黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒g2。

22、由此可以看出，本发明所述菌株是4株安全性高、竞争优势强的生防菌株，能显著抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染，可以单独或复配制成菌剂作为生物防治剂。

技术特征：

1.不产毒黄曲霉，其特征在于，选自黄曲霉aspergillus flavus pa04、ca04、sz05、sf01中的至少一种；

2.根据权利要求1所述的不产毒黄曲霉，其特征在于，所述sf01于2023年9月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cctcc no.40823；

3.根据权利要求1或2所述的不产毒黄曲霉，其特征在于，所述不产毒黄曲霉均不产黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒g2。

4.生防菌剂或玉米胚芽菌剂，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的不产毒黄曲霉单独或复配得到。

5.根据权利要求4所述的生防菌剂或玉米胚芽菌剂，其特征在于，通过以下方法制备得到：

6.根据权利要求4或5所述的生防菌剂或玉米胚芽菌剂，其特征在于，在种子发芽后及开花前2-3周施用。

7.根据权利要求1-3任一项所述的不产毒黄曲霉在竞争抑制黄曲霉菌产毒素中的应用。

8.一种显著降低农产品中黄曲霉毒素含量的方法，其特征在于，在农产品种子发芽后及开花前2-3周施用根据权利要求4或5所述的生防菌剂或玉米胚芽菌剂。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农产品为玉米、花生、小麦、辣椒、棉花、杏仁等。

技术总结
本发明提供了一种不产毒黄曲霉、所得生防菌剂及其应用，属于微生物技术领域。所述不产毒黄曲霉选自黄曲霉Aspergillus flavus PA04、CA04、SZ05、SF01中的至少一种；所述SF01的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PA04的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述CA04的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述SZ05的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。上述不产毒黄曲霉菌株是安全性高、竞争优势强的生防菌株，能显著抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素污染，可以单独或复配制成菌剂作为生物防治剂。

技术研发人员：孔青,王婉宁,徐嘉
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4