盐生草Hg14371基因及其抗盐性的应用

本发明属于植物生物工程和转基因，具体涉及盐生植物盐生草根系耐盐基因hg14371及其功能应用。

背景技术：

1、盐渍化是指在自然或者人为因素的影响下，可溶性盐从土壤底层进入到土壤表面并积累的过程。土壤盐渍化对农业生产的阻碍作用极其显著，并造成了生态环境的严重恶化及粮食供给不足。随着我国经济的不断发展、人们对农业生产要求的不断提高，通过灌溉和施肥等方式使得农作物提升产量与土壤盐渍化进一步加重的矛盾日益突出。其中，盐胁迫是植物受到的最主要的非生物胁迫之一，实质是外界盐分含量高到改变水势使植物细胞或者组织渗透压增大，从而对植物产生影响(杨劲松等，2022)。

2、对于大部分不耐盐的植物而言，当受到盐胁迫时，其生长将会将会被抑制。盐分对植物根、茎、叶及株高等均会造成一定影响。当植物摄入大量的na+、cl-会使其自身的离子平衡失调，使植物受到毒害。植物受到盐胁迫时，na+大量积聚，并将位于细胞质膜上的ca2+取代，破坏细胞膜结构，影响植物的正常发育，限制植物对ca2+、fe2+、k+等营养离子的吸收(刘佳等，2021)。

3、植物通过环境、激素、以及相关基因的调控来应对盐胁迫，使用传统育种技术提高植物的耐盐不仅耗时耗力且效果不理想。大量研究表明，植物耐盐性的提高是由于相关基因在植物中的过量表达起作用。自20世纪50年代以来，随着分子生物学的发展，利用现代分子生物技术挖掘耐盐基因，改良植物的耐盐性，进而提高植物产量已经成为研究者们研究的热点，若干个与植物耐盐性相关的基因得到克隆与鉴定，随着研究者们对基因组学研究的不断深入，未来将会有更多的耐盐相关基因得到鉴定。

4、盐生植物通过漫长的生物进化史本身累积了丰富的耐盐碱基因，能够在盐碱土中良好生长，引起了不少研究人员的密切关注。通过对盐生植物系统研究其耐盐机制，对提高作物的耐盐性至关重要(薛琼琼等,2021)。

5、盐生植物(halophytes)在18世纪以前就出现在人们的视野，是能够在高盐环境下生存的植物。目前，研究者们已从盐生植物中挖掘到了大量耐盐基因，并通过转化模式植物拟南芥和烟草验证其耐盐性功能。盐生植物盐生草(halogeton glomeratus)为一年生草本植物，藜科盐生草属，广泛分布于甘肃西部旱区。盐生草长期生存于干旱盐碱环境下，地上部茎和叶高度肉质化，具有较强的保水、防风固沙、抗旱和耐盐的能力，在抗盐基因的挖掘和耐盐抗旱功能研究以及为作物育种提供候选基因等方面具有重要的意义(周振国等，2018)。

6、现有技术存在的问题：现有技术中未报道关于盐生草根系耐盐基因hg14371参与响应盐胁迫调控方面的功能和应用。本发明以盐生草根系耐盐基因hg14371为切入点，克隆基因hg14371。进一步通过载体构建、亚细胞定位、拟南芥转化和构建酵母表达载体及酵母生长表型分析等方法研究盐生草根系耐盐基因hg14371的功能，旨在进一步解析盐生草根系耐盐机理并为后期培育耐盐品种提供耐盐候选基因，为今后改良栽培作物耐盐性方面提供技术依据。

技术实现思路

1、本发明要解决的关键技术问题在于提供盐生草根系耐盐基因hg14371的克隆及其响应盐胁迫的功能验证。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

2、1.盐生草hg14371基因促进na+外排的应用，所述盐生草hg14371基因cds序列如序列表seq no.1所示，所述促进na+外排的应用通过过表达hg14371基因实现。

3、2.盐生草hg14371基因增强拟南芥抗盐性的应用，所述盐生草hg14371基因cds序列如序列表seq no.1所示，所述增强拟南芥抗盐性的应用通过过表达hg14371基因实现。

4、3.盐生草hg14371基因的应用，所述盐生草hg14371基因在拟南芥原生质体细胞核膜上或其他细胞器的膜结构上表达的予以实现。

5、4.盐生草hg14371基因，所述基因cds序列如序列表seq no.1所示。

6、5.盐生草根系耐盐基因hg14371的克隆和载体构建方法，所述方法包括：(1)植株材料和试剂选择；(2)rna提取与反转录；(3)引物设计和基因克隆；(4)构建过表达载体、亚细胞定位表达载体及酵母异源表达载体；(4)拟南芥遗传转化及转基因拟南芥抗性筛选；(5)转基因拟南芥获得及生长表型分析；(6)酵母生长表型分析。

7、有益效果：盐生草具有适应干旱、盐碱、高温等严酷环境的特点，是获取耐盐基因的优良野生资源，本发明在盐生草根系转录组学及蛋白组学分析的基础上，选取盐诱导表达基因的cds序列，利用基因克隆的方式，成功克隆hg14371基因，并构建过表达载体侵染拟南芥进行抗性筛选和表型分析；构建酵母异源表达载体并进行表型分析。

8、发现在200mm的nacl处理下，拟南芥生长缓慢，野生型植株出现枯黄等症状，但转hg14371基因植株可以正常生长。说明hg14371基因能显著提高拟南芥耐盐性，该基因可应用于耐盐作物新品种的培育当中。

9、发现在在外界na+、k+浓度一致的情况下，与转化pyes2空载体的酵母菌株相比，转化hg14371基因的酵母菌株长势明显旺盛，当培养基中na+浓度增加至0mm后，菌落长势表型对比现象更加明显，表明hg14371基因的转入回补了axt3的缺陷，减少了na+对酵母细胞的毒害，说明hg14371基因同样参与na+的外排转运。

10、当培养基中k+浓度达到100mm时，转化pyes2空载体的菌株才开始生长，但稀释1000倍的菌液不生长；当培养基中k+浓度为0.2mm时，转化hg14371基因的酵母菌株可以生长，当k+浓度达到100mm时，稀释1000倍的菌液也可以正常生长。说明该基因可以弥补k+缺陷型酵母菌株cy162的功能，其在酵母中的超表达可以介导k+的吸收，使酵母菌株在低k+浓度下也可以正常生长。

11、hg14371基因转入na+敏感型酵母菌株axt3能够减少高浓度na+对酵母细胞的毒害，说明，hg14371基因参与高浓度na+的外排；hg14371基因转入k+缺陷型酵母菌株cy162，在酵母中的超表达具有弥补k+缺陷型酵母菌株cy162的功能，即在酵母中介导k+的吸收。说明盐生草根系耐盐基因hg14371能够参与响应盐胁迫，进而发挥作用提高盐生草的耐盐性。

技术特征：

1.盐生草hg14371基因促进na+外排的应用，其特征在于所述盐生草hg14371基因转录本序列如序列表seq no.1所示，所述促进na+外排的应用通过过表达hg14371基因实现。

2.盐生草hg14371基因增强拟南芥抗盐性的应用，其特征在于所述盐生草hg14371基因cds序列如序列表seq no.1所示，所述增强拟南芥抗盐性的应用通过过表达hg14371基因实现。

3.根据权利要求2所述hg14371基因增强拟南芥抗盐性的应用，其特征在于所述盐生草hg14371基因在拟南芥原生质体细胞核膜上表达予以实现。

4.盐生草hg14371基因，其特征在于所述基因cds序列如序列表seq no.1所示。

5.盐生草根系耐盐基因hg14371的克隆和载体构建方法，其特征在于所述方法包括：(1)植株材料和试剂选择；(2)rna提取与反转录；(3)引物设计和基因克隆；(4)构建过表达载体、亚细胞定位表达载体及酵母异源表达载体；(4)拟南芥遗传转化及转基因拟南芥抗性筛选；(5)转基因拟南芥获得及生长表型分析；(6)酵母生长表型分析。

6.一种载体，其特征在于所述载体包含如序列表seq no.1所示核苷酸片段。

技术总结
本发明涉及盐生草根系耐盐基因Hg14371的基因克隆和功能应用，属于植物生物工程技术领域。本发明首次从盐生草根系中克隆到耐盐基因Hg14371，通过克隆盐生草根系耐盐相关基因Hg14371，构建亚细胞定位表达载体进行基因亚细胞定位；构建过表达载体，稳定遗传转化拟南芥进行耐盐性鉴定；构建酵母异源表达载体，进一步验证Hg14371基因的功能，发现Hg14371基因参与高浓度的Na<supgt;+</supgt;的外排及介导K<supgt;+</supgt;的吸收。本发明提供了有关盐生草根系耐盐基因Hg14371的克隆及功能应用，将为研究植物耐盐机制、提高植物耐盐性提供参考，为探索用于耐盐育种的基因提供了宝贵的资源。

技术研发人员：王化俊,汪军成,姚立蓉,李葆春,孟亚雄,马小乐,司二静,杨轲,张宏,何川,汪欣瑶
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8