巨桉二肽转运蛋白质编码基因EgNPF8.1的应用

本发明属于植物基因工程和生物，涉及一种丛枝菌根诱导型巨桉二肽转运蛋白基因egnpf8.1及其在提高巨桉丛枝菌根真菌侵染率及氮和磷高效吸收中的应用。

背景技术：

1、氮(n)和磷(p)是植物生长与发育所必需的两种大量营养元素，土壤中氮和磷有效含量直接影响植物的正常生长发育和生产力的提升。然而，陆生植物面临着农林土壤中经常同时出现的各种营养缺乏的胁迫，例如低氮和低磷。近年来，缺氮和缺磷等生态因素对森林和树木生产的影响已成为人们关注的主要问题，其不利影响威胁着木材的产量和质量。为了保证可持续的木材来源以满足日益增长的市场需求，世界范围内的林业普遍依赖于大量使用氮肥和磷肥来提高木材产量和质量。然而，长期使用化肥对农林生态环境产生严重的负面影响，因此，可持续性林业发展要求林木对土壤中氮素和磷素具有更加高效的吸收和利用能力，以减少林业生产的肥料和成本投入。

2、菌根共生体最早出现在大约4亿多年前，并经历了漫长的演变过程，延续至今仍广泛且保守地存在于自然界各种生态系统中(genre et al.,2020)。科学家们对于菌根的研究至今已有150年的历史(bonfante,2018)，对丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal，am)真菌与宿主植物形成的丛枝菌根营养吸收途径的研究方兴未艾(harrison et al.,2002；breuillin-sessoms et al.,2015；wang et al.,2020；shi et al.,2021；xie et al.,2022)，然而丛枝菌根中多种营养元素相互作用分子机制的研究却鲜见报道(bonneau etal.,2013；xie et al.,2019)，这极大地限制了菌根生物学技术在农林业生产实践中的广泛应用。桉树因其在生态保护、固碳增汇、木材生产、生物能源和造纸等方面具有重要生态价值和经济价值，在全球范围内被广泛种植。然而，生产力低下仍是目前桉树人工林生产中最关键的问题。然而，桉树根际土壤中富含菌根真菌资源，菌根真菌能与桉树根系形成互惠共生体，并促进桉树从土壤中吸收与转运磷和氮等矿质营养元素，并调节植物体内氮磷营养平衡，改善桉树的生长与健康从而提升其生产力。因此，研究一种提高巨桉(eucalyptusgrandis)丛枝菌根侵染率与氮磷高效吸收的方法成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种巨桉的二肽转运蛋白质编码基因，以及该基因编码的蛋白质、该基因在氮和磷吸收方面的相关应用；

2、本发明第二个目的是提供一种促进巨桉幼苗菌根化、氮磷营养高效吸收和快速生长的营养液配方。

3、本发明第三个目的是提供一种促进巨桉丛枝菌根真菌侵染与氮磷高效吸收的方法，以解决上述背景技术中提出的关键科学问题。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、巨桉二肽转运蛋白质编码基因egnpf8.1的应用，包括下述应用中的至少一种：

6、a)在促进丛枝菌根真菌对巨桉根系的定殖中的应用；

7、b)在提高菌根化巨桉植物对外界氮磷高效吸收中的应用；

8、c)在判定菌根化巨桉植物对有机氮的利用效率中的应用。

9、优选的，所述有机氮包括小分子肽、氨基酸和蛋白胨等中的至少一种；所述小分子肽包括含有2～10个氨基酸残基的小分子肽；具体的，所述小分子肽为二肽；所述二肽包括但不限于l-亮氨酸二肽(leu-leu)、l-组氨酸-l-亮氨酸二肽(his-leu)和谷氨酸-谷氨酸二肽等中的至少一种。

10、进一步的，包括下述应用中的至少一种：

11、a1)在促进丛枝菌根真菌对巨桉根系的侵染率中的应用；具体的，与基因沉默植株相比，对照植株根中的侵染率显著提高；再具体的，在缺磷(-p+n)或缺氮(+p-n)条件下，与基因沉默植株相比，对照植株根中的侵染率显著提高；

12、a2)在促进丛枝菌根真菌对巨桉根系的丛枝丰度中的应用；具体的，与基因沉默植株相比，对照植株根中的丛枝丰度显著提高；再具体的，在缺磷(-p+n)或施磷施氮(+p+n)条件下，与基因沉默植株相比，对照植株根中的丛枝丰度显著提高；

13、优选的，所述的丛枝菌根真菌包括异形根孢囊霉(rhizophagus irregularis)，进一步的，包括异形根孢囊霉(r.irregularis daom 197198)。

14、b1)在提高菌根化巨桉植物对外界氮高效吸收中的应用；优选的，所述的氮包括硝态氮、氨基酸、小分子肽、蛋白胨等中的至少一种。所述小分子肽包括含有2～10个氨基酸残基的小分子肽；具体的，所述小分子肽为二肽；所述二肽包括但不限于l-亮氨酸二肽(leu-leu)、l-组氨酸-l-亮氨酸二肽(his-leu)和谷氨酸-谷氨酸二肽等中的至少一种。

15、具体的，对照植株地上和地下部组织中总氮含量显著高于同一营养条件下的基因沉默植株。

16、b2)在提高菌根化巨桉植物对外界磷高效吸收中的应用；具体的，在缺氮(+p-n)或施磷施氮(+p+n)条件下，对照植株地上部组织中总磷含量显著高于同一营养条件下的基因沉默植株；在施磷施氮(+p+n)条件下，对照植株地下部组织中总磷含量显著高于同一营养条件下的基因沉默植株。

17、优选的，所述基因沉默植株是利用病毒诱导基因沉默(virus-induced genesilencing，简称vigs)技术，通过在egnpf8.1基因的5'端设计一个rnai沉默区域，以靶向目标基因的特异性区域，得到egnpf8.1-rnai沉默植株。

18、优选的，所述的rnai沉默区域为相对于翻译起始密码子(atg)-60～+110的rnai沉默区域。

19、优选的，所述巨桉二肽转运蛋白质编码基因egnpf8.1的核苷酸序列如seq idno.1所示。

20、所述巨桉二肽转运蛋白质egnpf8.1的氨基酸序列如seq id no.2所示。

21、本发明还提供一种提高丛枝菌根真菌侵染巨桉及其氮磷吸收的方法，包括如下步骤：

22、在巨桉幼苗根部接种异形根孢囊霉，然后施加改良long-ashton营养液，在提高丛枝菌根真菌对巨桉根系的定殖的同时，促进巨桉对氮素和磷素的协同高效吸收。

23、优选的，所述接种异形根孢囊霉的时间为60天以上；进一步为60～150天。

24、优选的，所述改良long-ashton营养液中磷(pi)的浓度为30μm～300μm；氮(n-no3-)的浓度为250μm～2500μm。

25、进一步的，所述改良long-ashton营养液的配方为mgso4·7h2o：0.75mm、k2so4：1mm、cacl2·2h2o：2mm、nah2po4：30μm～300μm、nano3：250μm～2500μm、fena·edta：0.025mm、mnso4·h2o：0.005mm、cuso4·5h2o：0.0005mm、znso4·7h2o：0.00025mm、h3bo3：0.025mm、namoo4·2h2o：0.0001mm，1g/l蛋白胨或者2.5mm小分子肽。

26、其中，所述小分子肽包括含有2～10个氨基酸残基的小分子肽；具体的，所述小分子肽为二肽；所述二肽包括但不限于l-亮氨酸二肽(leu-leu)、l-组氨酸-l-亮氨酸二肽(his-leu)和谷氨酸-谷氨酸二肽等中的至少一种。

27、其中，先将蛋白胨配制成浓度为10g/l的蛋白胨溶液，在添加至改良long-ashton营养液中进行配制；蛋白胨溶液需单独配制，现配现用。

28、本发明选用华南地区乡土树种巨桉(e.grandis)作为宿主植物，通过接种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(r.irregularis daom 197198)并在不同氮磷水平下处理60天后，记录植物形态指标并测定巨桉生理指标。通过株高、根长和生物量分析，探索最适巨桉生长的氮磷配比。同时，对巨桉地上和地下部分组织中总氮和总磷含量测定，并对接种am真菌异形根孢囊霉的巨桉根系进行侵染率测定。

29、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

30、(1)本发明提供的egnpf8.1基因功能参与了丛枝菌根真菌的侵染和菌根共生体发育过程，基因转录水平分析表明egnpf8.1受am真菌异形根孢囊霉侵染的显著诱导表达(图3)。

31、(2)本发明通过对巨桉的二肽转运蛋白质编码基因egnpf8.1的功能研究，结果表明该基因编码一个二肽转运子(图4)，并在巨桉丛枝菌根氮与磷吸收途径中发挥着重要作用，该基因的沉默对巨桉丛枝菌根氮与磷吸收途径具有显著的影响(图5)，可用于菌根林木的遗传改良。

32、(3)基于本发明中egnpf8.1基因的功能，结合巨桉丛枝菌根中氮磷协同效应的生理与分子机制，在巨桉盆栽试验中施加有机氮(蛋白胨，aobox)与接种异形根孢囊霉(r.irregularis)，证实有机氮添加对菌根化巨桉氮磷营养吸收和生长的作用效果，同时提供一种有效可靠的巨桉快速育苗的营养液配方(表2)。

33、(4)本发明通过添加不同氮和磷浓度的营养液，观察am真菌异形根孢囊霉(r.irregularis)的侵染率、侵染强度和丛枝丰度，低磷加氮条件下，显著促进巨桉丛枝菌根的形成与发育。利用基因组学和实时荧光定量pcr方法，在巨桉中鉴定到一个受丛枝菌根诱导表达的二肽转运蛋白质编码基因egnpf8.1，该基因的表达在异形根孢囊霉(r.irregularis)侵染条件下能够显著促进巨桉对有机氮(比如亮氨酸二肽)的吸收，并且能维持巨桉丛枝菌根的正常发育。根据研究结果，进一步改良菌根植物营养液配方，并额外添加有机氮(蛋白胨)能够更加显著促进巨桉对氮和磷的吸收，从而加快巨桉幼苗的生长和提高巨桉生物量。本发明经过创造性的探索试验，调制营养液中营养配比，提高巨桉丛枝菌根真菌侵染率及氮与磷的高效吸收，为巨桉菌根化育苗提供新的生物学技术。