一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物、引物组合以及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物、引物组合以及其应用。

背景技术：

1、蚕豆病是一种x连锁不完全显性遗传性溶血性疾病，其发病机制主要涉及g6pd基因的突变。g6pd即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，缺乏该酶的功能导致全球约五亿人罹患此病。g6pd突变的分布具有典型的种族和地域差异。在中国，蚕豆病是一种高发疾病，呈现南部高发、北部低发的地域分布特点，患病率在0.2％至44.8％之间。该疾病主要分布于长江以南的各个省份，尤其在海南、广东、广西、云南、贵州和四川等省份发病率较高。某些人群的基因携带率甚至可高达16％，而在北方地区则较为罕见。

2、g6pd是磷酸戊糖途径的关键酶，其主要作用是产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)，以维持细胞内适当的还原环境，尤其在红细胞中具有重要作用。因此，g6pd功能障碍会导致红细胞处理氧化应激的能力下降。该功能障碍的发生与多种基因突变相关，其中最常见的是单核苷酸替换突变，其次是多个突变、缺失和内含子突变。g6pd缺乏症主要由这些基因突变引起。g6pd基因位于x染色体长臂2区8带(xq28)，总长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码了515个氨基酸。目前已经描述了400多个基因突变位点与g6pd缺乏症相关。在中国，也报道了多个基因突变位点，其中c.1388g>a、c.1376g>t和c.95a>g是最常见的三种基因突变类型，占据了70％以上的比例，并且仅在华人及华裔后代中有报道。

3、由于g6pd缺乏症通常是一种x连锁隐性遗传病，男性的发病率显著高于女性。男性可能是正常的半合子或缺陷的半合子，而女性则可能是正常纯合子、缺陷的纯合子或杂合子。女性杂合子是表达野生型细胞和表达缺失突变细胞的嵌合体。然而，由于x染色体失活机制，杂合子女性也有可能出现轻微的症状。

4、多年来，针对g6pd缺乏症的检测方法不断更新，目前主要包括四氨蓝纸片定性法、变性珠蛋白小体生成试验、高铁血红蛋白还原试验(mhb-rt)、光斑点法(fst)和g6pd活性测定等。这些方法操作简便、价格低廉，但准确性有所限制，容易产生假阳性或假阴性的结果，特别是在对女性杂合子进行检测时容易出现漏诊情况。常规的基因诊断方法在解决g6pd缺乏症女性杂合子检出方面取得了一定进展。然而，这些方法存在操作繁琐、通量低、易产生假阴性或假阳性结果的缺点，因此无法成为临床基因诊断的最佳选择。例如，等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法需要进行繁琐的聚合酶链式反应(pcr)和后续的杂交盒洗脱等步骤，杂交及洗脱条件的控制可能导致误诊和漏诊。多重等位基因特异性pcr法经济简便，但对引物设计要求较高，并且在pcr反应体系中，多对引物可能相互干扰，影响结果的准确性。高分辨率熔解曲线法操作简便，但对于不同突变位点的检测往往需要多次操作，通量较低，而单管多位点检测结果难以解读，因此在临床应用方面受到限制。现有技术中，中国发明专利申请cn103695554a开发了用于g6pd缺乏症诊断的基因检测膜条及相关引物，针对已报道的几个常见突变位点进行了检测。然而，该技术中的位点覆盖不够全面可能导致漏诊，不利于该疾病的遗传筛查和早期干预。另外，中国发明专利申请cn104450925a利用荧光定量pcr设计了覆盖多数g6pd突变人群的常见位点引物和探针，以进行单独分型。但该方法仍存在标准化程序、仪器规格和试剂选择的多样性，导致部分结果重复性较差，给广泛应用带来了阻碍。因此，在该领域仍需要探索一种新的g6pd缺乏症遗传检测技术，以克服现有方法的局限性。

5、植入前遗传学诊断(pgd)是一种通过对胚胎进行遗传学检测的技术，旨在筛查可能携带遗传病或染色体异常的胚胎，并选择正常胚胎进行移植。pgd技术在遗传病家族史、染色体结构异常、高龄产妇等情况下特别有用。它可以帮助减少某些遗传病的发生率，并提高辅助生殖技术的成功率。目前尚无公开技术能很好地阻断蚕豆病家族遗传的发生。

6、二代测序技术，也被称为下一代测序(next-generation sequencing，ngs)，是一种高通量的基因组分析方法。它能够快速、准确地测定dna或rna样本中的序列信息，从而实现了大规模基因检测和分析的能力。二代测序技术可以用于检测胚胎携带的基因突变，包括点突变、缺失、插入等各种类型的突变。这有助于筛选出携带遗传疾病的胚胎。与传统pgd方法相比，二代测序通常需要的样本量更少，从而更为非侵入性，减少了对患者的生理影响。二代测序技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测到低频突变，减少了假阳性和假阴性的风险。

7、传统的胚胎植入前遗传学诊断(pgd)检测通常采用毛细管电泳技术来检测核酸中的短串联重复(short tandem repeats，str)构建单体型，以评估胚胎是否携带致病突变，并进而判断其是否符合合格胚胎的标准。str的应用需要从胚胎中提取多个细胞进行分析，然而这一过程可能对胚胎的发育和存活率产生不利影响。此外，str分析存在一系列问题，包括杂合性缺失、基因扩增失败、非特异性扩增等，这可能导致假阳性或假阴性结果的出现，进而需要进行多次验证和确认，增加了诊断的不确定性。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物，该组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物能够应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的试剂。

2、本发明的第二个目的在于提供上述生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。

3、本发明的第三个目的在于提供针对所述用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物检测用的引物组合物。

4、本发明的第四个目的在于提供用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物的试剂盒。

5、本发明的第五个目的在于提供用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合。

6、本发明的第六个目的在于提供包含上述特异性引物组合的试剂盒。

7、本发明的第七个目的在于提供上述试剂盒在制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断产品中的应用。

8、为实现上述发明的第一个目的，本发明采用的技术方案如下：

9、本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物，包括x号染色体携带的77个snp位点，其中包含位于g6pd突变缺失区域中的2个特异性snp位点、处于2个特异性snp位点上游区域的42个snp位点、处于2个特异性snp位点下游区域的33个snp位点；

10、所述77个snp位点如下：

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14、其中，所述2个特异性snp位点在g6pd基因中的位置分别为nm_000402.4(g6pd):c.871g>a和nm_000402.4(g6pd):c.1311>a。

15、其中，生物标注物采用上述77个snp有效位点，通过对已知个体或群体的多态性信息与已有数据相结合，能够快速准确地确定出具有高突变率的候选序列。另外，采用上述77个snp位点信息进行分析，能实现对不同配偶的胚胎前诊断、胎儿诊断和流产组织诊断，从而更加精准地建立单体型。因此，能够对候选基因序列进行快速准确地鉴定，并能将其定位到特定位置。

16、为实现上述发明的第二个目的，本发明采用的技术方案如下：

17、本发明提供上述生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。

18、为实现上述发明的第三个目的，本发明采用的技术方案如下：

19、本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物检测用的引物组合物，所述引物组合物中各引物的信息如下：

20、

21、

22、

23、为实现上述发明的第四个目的，本发明采用的技术方案如下：

24、本发明提供用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物组合物。

25、为实现上述发明的第五个目的，本发明采用的技术方案如下：

26、本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包含42对上游引物，2对含致病突变位点的特异性引物，33对下游引物；

27、所述特异性引物组合的序列信息如下：

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30、

31、其中，这些特异性引物的特点是：(1)各特异性引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；2)一般18-24碱基，各特异性引物之间不能互补，尤其避免3’端互补，避免出现二聚体或发夹结构；3)上下游靶向扩增区间至少包含一个所筛选的snp位点。

32、为实现上述发明的第六个目的，本发明采用的技术方案如下：

33、本发明提供用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物的试剂盒，含有上述所述的特异性引物组合。

34、为实现上述发明的第七个目的，本发明采用的技术方案如下：

35、本发明提供上述试剂盒在制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断产品中的应用。

36、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

37、(1)本发明通过x号染色体携带的77个snp位点，作为用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物。该生物标志物应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断试剂或试剂盒。另外，用于检测该生物标志物的引物组合物和特异性引物组合应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，能更好地检测蚕豆病(g6pd缺乏综合征)。

38、(2)本发明的生物标志物含有77个snp位点，采用上述多个snp有效位点进行分析，能用于用于蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍检测，进而能够更好构建单体型，一旦发生突变则能更好的检测蚕豆病(g6pd缺乏综合征)。

39、(3)用于检测该生物标志物的引物组合物和特异性引物组合应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，由于引物组合物针对77个snp位点进行分析，可用于不同配偶的胚胎移植前诊断，通用性好；由于引物组合物和特异性引物组合是基于第二代测序技术，因此，本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可以对g6pd基因附近的多个snp进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针；本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可以高通量地进行g6pd突变的单倍体，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析；由于本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品能一次对大量样品进行分析，因此本发明对g6pd突变的单倍体分析的成本低；本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可用于3～5个细胞的分析，因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测，灵敏度高；因此，本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品具有通用性、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，通过对多位点snp测序、防止扩增等位基因脱扣(ado)造成的检测误诊，能够对胚胎移植前蚕豆病致病位点精准地检测。