一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用

本发明涉及微生物，具体涉及一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。

背景技术：

1、在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。

2、猪轮状病毒性腹泻(porcine rotaviral diarrhea)是一种常见的猪病，由猪轮状病毒(porcine rotavirus,porv)引起。这种病毒主要影响仔猪，尤其是新生至六周龄的仔猪，导致严重的腹泻、脱水和电解质失衡。病毒通过粪-口途径传播，比如可以通过接触病毒携带者的粪便、唾液等传播，在养猪场尤其是密集养殖环境中容易引发疫情。porv感染后，通常在1至3天内开始表现症状，主要包括水样腹泻、呕吐、食欲不振和体重下降，严重的可导致严重脱水和营养不良，并导致死亡。此外，porv还可能导致肺炎、肝炎和肠炎等疾病，引起猪的死亡率和出栏率的显著增加，严重影响养殖业的经济效益。此外，porv还可以引起人类的腹泻、肺炎、肝炎和肠炎等疾病，因此，猪轮状病毒的传播对养殖业也是一个巨大的威胁。

3、目前，针对猪轮状病毒性腹泻的治疗主要是支持性和对症治疗，包括补充水分和电解质、营养支持、控制继发性细菌感染、抗生素治疗、抗病毒治疗和免疫治疗等。此外，还可以采取预防措施，包括良好的卫生管理、定期清洁和消毒、疫苗接种、控制病毒携带者的接触、改善饲养环境和提高动物免疫力等。早期诊断和有效的管理措施对于控制疫情和减少经济损失至关重要。

技术实现思路

1、本发明提供了一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。该菌株具备良好的性能，能够很好的在动物肠道(特别是猪肠道)内定植，能够有效地减少猪轮状病毒在肠道内的病毒载量，并预防和改善猪轮状病毒性腹泻，减轻炎症，增强机体免疫力，保护肠道健康。

2、具体地，本发明提供了下述的技术方案。

3、在本发明的第一方面，本发明提供了一株粪肠球菌，其名称为粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363，所述菌株已于2023年06月25日保藏于位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 20231093。

4、本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363分离自泰国蝙蝠粪便，该菌株在mrs培养基上生长有边缘整齐、表面光滑的乳白色菌落，为革兰氏阳性菌。

5、本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363具有良好的生长性能(2-8h为指数生长期，12h后稳定)。

6、本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363耐酸(在ph＝3的环境下2h存活率为29.80％)、在人工胃液中3h存活率为22％，在人工肠液中6h存活率大于100％，具有良好的耐受肠道内的消化酶，以及良好的耐热性能，60摄氏度及以上的环境下仍然可存活。

7、本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363具有良好的表面疏水性和自聚能力，疏水性与其在肠道中的粘附能力和定植能力有关，一般来说，疏水性强的益生菌具有较高的粘附能力和定植能力，能够更好地与肠道表面形成亲密的接触，而自聚能力可以增加菌株的活性和稳定性，使菌株可以相互保护，并阻止致病菌与肠道表面结合，从而减少感染的风险，以及增加菌株的协同效应，从而使菌株发挥更强的功能。

8、本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363具有良好的抑菌能力，对沙门氏菌(特别是猪霍乱沙门氏菌)抑菌性较好，菌体对沙门氏菌的抑制率可达100％，同时，菌液、菌体和上层清液均表现出良好的抑菌能力。

9、在本发明的第二方面，本发明提供了本发明所述粪肠球菌(enterococcusfaecalis)b363和/或其代谢物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：

10、(1)抗猪轮状病毒；

11、(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；

12、(3)减轻炎症；

13、(4)增强机体免疫力；和

14、(5)抗菌。

15、在本发明的一些实施方式中，本发明提供了本发明所述粪肠球菌(enterococcusfaecalis)b363和/或其代谢物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：

16、(a)提高血液中γ干扰素(ifn-γ)的含量；

17、(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(ifn-α)的含量；

18、(c)降低血液中白细胞介素1β(il-1β)的含量；

19、(d)提高血液中白细胞介素6(il-6)的含量；和

20、(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白a(siga)的含量。

21、在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品包括食品、药品、日化用品、饲料、饲料添加剂、微生态制剂和抗菌剂。

22、在本发明的实施方式中，本发明以仔猪为实验对象研究了服用本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363后以猪轮状病毒对仔猪攻毒后的仔猪的一系列变化和影响。

23、结果表明，本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363能够在仔猪肠道内良好的定植，能够显著降低感染猪轮状病毒的仔猪肠道内(特别是小肠、空肠、回肠、盲肠、直肠)以及肠系膜淋巴结(mln)内的病毒载量，具有良好的抗猪轮状病毒的作用。

24、同时，服用了本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363的仔猪虽然在攻毒后出现了少量且短暂的腹泻行为，从粪便考察的结果来看，其粪便能够很快从粘稠和不成形的状态改善为湿润和成形的粪便，并后续一直保持这种良好的状态，这表明本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363能够很好的预防和改善猪轮状病毒性腹泻。

25、并且，在实验中检测了免疫指标ifn-γ、tnf-α、il-1β、il-6和siga的变化情况，结果表明在porv感染后的第三天，服用了本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363的仔猪血清中的ifn-γ水平明显增加，tnf-α的含量明显减少，il-1β的含量明显减少以及il-6的含量明显增加，以上表明本发明所述菌株能够通过诱导ifn-γ的分泌提高仔猪的抗病毒能力，能够有效缓解炎症，可能通过协同炎症小体拮抗porv的感染。以及，检测发现仔猪粪便中的siga的含量明显增加，siga抗体是粘膜证据的抗原特异性免疫的第一道防线，能够防止病原体与粘膜表面结合，从而防止细菌和病毒进入肠道。

26、以及，在实验中还使用流式细胞术检测了t淋巴细胞和b淋巴细胞的变化情况，结果本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363提高了porv感染后脾脏中cd8+ifn-γ+t细胞的比例，推测本发明所述菌株可以通过增加脾脏中cd8+ifn-γ+t细胞的比例，增强机体对porv感染的免疫反应，以及增加了肠道中b细胞的比例，增强了机体对porv感染的免疫反应。

27、此外，通过h&e染色观察小肠组织的病理切片，发现相较于pbs组出现的十二指肠病理变化严重，可见部分肠道绒毛断裂，肠道绒毛上皮细胞脱落，肠腔中可见脱落的组织和细胞碎片和少量炎性细胞，以及pbs攻毒组出现的十二指肠绒毛萎缩散落，断裂，分布稀疏，肠道结构被破坏的情况，使用了本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363(b363组)结果中十二指肠均未见明显病理组织学变化，肠绒毛轻度萎缩，轮廓清晰，分布较密，结构完整。以上结果表明本发明所述的所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363能够有效地保护肠道组织来自于猪轮状病毒的损伤。

28、在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物，其包括本发明所述的粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物。

29、在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物具备下述中至少一项所述的用途：

30、(1)抗猪轮状病毒；

31、(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；

32、(3)减轻炎症；

33、(4)增强机体免疫力；和

34、(5)抗菌。

35、在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物具备下述中至少一项所述的用途：

36、(a)提高血液中γ干扰素(ifn-γ)的含量；

37、(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(ifn-α)的含量；

38、(c)降低血液中白细胞介素1β(il-1β)的含量；

39、(d)提高血液中白细胞介素6(il-6)的含量；和

40、(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白a(siga)的含量。

41、在本发明的第四方面，本发明提供了一种产品，其包括本发明所述的粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物，或包含本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物物的组合物。

42、在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品包括食品、药品、日化用品、饲料、饲料添加剂、微生态制剂、抗菌剂和试剂，并且本发明所述产品具备下述中至少一项所述的用途：

43、(1)抗猪轮状病毒；

44、(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；

45、(3)减轻炎症；

46、(4)增强机体免疫力；和

47、(5)抗菌。

48、在本发明的一些实施方式中，本发明所述产品具备下述中至少一项所述的用途：

49、(a)提高血液中γ干扰素(ifn-γ)的含量；

50、(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(ifn-α)的含量；

51、(c)降低血液中白细胞介素1β(il-1β)的含量；

52、(d)提高血液中白细胞介素6(il-6)的含量；和

53、(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白a(siga)的含量。

54、在本发明的一些实施方式中，本发明所述组合物或产品中包含本发明所述的粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物，以及，在此基础上，所述组合物或产品品中还可以包含至少一种对动物安全的辅料，或者其他治疗有效的成分。其中，合适的辅料可以是本领域已知的常规种类，比如溶剂、缓冲剂、稀释剂、冻干保护剂等等。组合物或产品可以为固体、半固体或者液体形式，其可根据本领域已知的任何常规方法进行制备。所述产品为饲料时，饲料中还可以进一步包含粮食类物质、微量元素、蛋白质等。

55、在本发明的一些实施方式中，所述组合物可以制备成菌粉，所述菌粉中可以进一步包含冻干保护剂，所述冻干保护剂的加入量为原料重量的2-95％，优选5-85％，所述冻干保护剂可采用本领域常规的冻干保护剂，比如脱脂奶粉等。在制备其他产品时，可直接以菌粉为原料进行添加。当然，这只是一种示例，本发明所述粪肠球菌(enterococcusfaecalis)b363也可以菌液、菌体或其上清液的形式作为原料以制备产品。

56、在本发明的第五方面，本发明提供了一种方法，其包括向受试者施用本发明所述的粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物或包含本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢产物的组合物或产品以实现下述至少一种功能：

57、(1)抗猪轮状病毒；

58、(2)预防和改善猪轮状病毒性腹泻；

59、(3)减轻炎症；

60、(4)增强机体免疫力；和

61、(5)抗菌。

62、在本发明的一些实施方式中，本发明所述方法还包括向受试者施用本发明所述的粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢物或包含本发明所述粪肠球菌(enterococcus faecalis)b363和/或其代谢产物的组合物或产品以实现下述至少一种功能：

63、(a)提高血液中γ干扰素(ifn-γ)的含量；

64、(b)降低血液中肿瘤坏死因子α(ifn-α)的含量；

65、(c)降低血液中白细胞介素1β(il-1β)的含量；

66、(d)提高血液中白细胞介素6(il-6)的含量；和

67、(e)提高肠道内分泌性免疫球蛋白a(siga)的含量。

68、在本发明中，所述“受试者”是指已经是或将要是治疗、观察或实验对象的动物，如猪，特别是仔猪。本文描述的方法可用于兽医应用。

69、在本发明中，实现上述功能的所需的有效量可以由考虑到自身知识、现有技术水平和本领域技术人员常规地确定，比如通过体内、体外或离体实验确定或展示该量，然后应用该量从而更好地实施本发明所述的方法。比如，在本发明的一些实施方式中，以本发明所述菌株灌胃治疗时，其剂量为1×109cfu/ml。

70、相较于现有技术，本发明的优势包括：本发明提供了一株粪肠球菌及其在抗猪轮状病方面的应用。该菌株具备良好的性能，能够很好的在动物肠道(特别是猪肠道)内定植，能够有效地减少猪轮状病毒在肠道内的病毒载量，并预防和改善猪轮状病毒性腹泻，减轻炎症，增强机体免疫力，保护肠道健康。