一种醋酸曲普瑞林的高效制备方法与流程

本发明属于药物合成，具体涉及一种醋酸曲普瑞林的高效制备方法。

背景技术：

1、瑞林类药物，是以促性腺激素释放激素(gnrh)结构为基础的一类人工合成的多肽类药物，用于治疗对性激素依赖疾病(前列腺癌、子宫内膜异位等)。国内常用的三种瑞林类药物即亮丙瑞林、戈舍瑞林和曲普瑞林，均有着巨大的应用市场。

2、曲普瑞林，一个合成十肽(含一个非天然氨基酸)，是天然促性腺释放激素的类似物，分子式c64h82n18o13，分子量1311.45，英文名：triptorelin。曲普瑞林一般以其醋酸盐的形式应用于临床，用于治疗需要把类固醇激素如雄性激素和雌性激素降低到低水平的患者，适用于前列腺癌、性早熟、生殖器内外的子宫内膜异位症、女性不孕症、子宫肌瘤等疾病。曲普瑞林结构中的肽序为pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2，结构式如下：

3、

4、专利us4010125公开了一种曲普瑞林的合成方法，其用benzhydryl amine树脂为起始原料，以boc保护的氨基酸为单体，通过逐个缩合制备十肽曲普瑞林；专利cn200710044419.7、cn201310013712.2和cn201310014882.2，均以rink amide mbha树脂或者rink amide am树脂为起始原料，以fmoc保护的氨基酸为单体，依次逐个接上氨基酸，裂解获得曲普瑞林粗品。上述逐个缩合的方法，由于曲普瑞林序列中存在arg-pro，在常规条件下用固相缩合需要过量氨基酸，且缩合效率低，容易出现缺陷肽。且发明人在研究上述合成方法时发现固相法合成醋酸曲普瑞林存在his、pyr易消旋的问题，d-his2-曲普瑞林杂质的产生严重影响后期的制备纯化，造成纯化收率低等问题。

5、专利cn201410743707.1、cn202011087408.9均采用固液相结合片段缩合的方式，前者是先固相制备片段一：pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-oh；液相制备片段二：fmoc-arg(pbf)-pro-gly-nh2；然后液相将片段一和片段二缩合，裂解、纯化制得曲普瑞林纯品，总收率38.7％；后者先固相合成片段一：boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-ser(tbu)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-leu-oh；液相制备片段二：arg(pbf)-pro-gly-nh2；然后液相将片段一和片段二缩合，裂解制得曲普瑞林粗品。但上述固液相结合片段缩合的方法中，his、pyr仍以固相法缩合，仍然存在上述his、pyr易消旋的问题以及d-his2-曲普瑞林杂质的生成，从而导致纯化困难、收率低。

6、专利cn202111007822.9公开了一种全液相合成曲普瑞林的方法，直接以片段fmoc-trp(boc)-ser(tbu)-osu为原料，共经过11个步骤制得曲普瑞林粗品，操作繁琐，原料更贵且总收率低。

7、基于上述现有技术中存在的问题，有必要开发一种新的曲普瑞林的制备方法，能够有效降低杂质生成，提高产品的收率、纯度，适应工业化生产。

技术实现思路

1、基于现有技术中存在的问题，本发明提供一种醋酸曲普瑞林的高效制备方法，采用固相和液相结合的片段缩合方式，能够显著降低杂质的生成，以高收率制得目标产品。

2、为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

3、一种醋酸曲普瑞林的高效制备方法，采用固相和液相结合的片段缩合方式，采用固相法制备片段1～7，采用液相法制备片段8～10，采用固相法将片段1～7和片段8～10缩合制得曲普瑞林10肽树脂。

4、其中，片段1～7序列为曲普瑞林主链肽序从gly端开始的第1～7个氨基酸；片段8～10序列为曲普瑞林主链肽序从gly端开始的第8～10个氨基酸组成的肽链。

5、优选地，所述醋酸曲普瑞林的高效制备方法包括以下步骤：

6、(1)固相法制备片段1～7：以rink amide mbha树脂为原料，溶胀rink amide mbha树脂并脱去fmoc保护，在偶联试剂和活化剂的作用下依次偶联具有n端fmoc保护且侧链保护的氨基酸，偶联的氨基酸单体顺序为：fmoc-gly-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh，合成全保护的曲普瑞林7肽树脂rink amide mbha-gly-pro-arg(pbf)-leu-d-trp(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-fmoc；

7、(2)液相法制备片段8～10：先将h-pyr-oh的n端和c端进行保护制得boc-pyr-coor1，然后boc-pyr-coor1与h-his(trt)-oh反应制得boc-pyr-his(trt)-oh，对boc-pyr-his(trt)-oh的c段进行保护得到boc-pyr-his(trt)-coor2，boc-pyr-his(trt)-coor2与h-trp(boc)-oh反应制得boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh；

8、(3)固相法将片段1～7和片段8～10偶联：将片段1～7脱fmoc保护，然后与步骤2中制得的boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh在偶联试剂和活化剂的作用下偶联制得rinkamide mbha-gly-pro-arg(pbf)-leu-d-trp(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-trp(boc)-his(trt)-pyr-boc；

9、(4)切割，将肽从树脂上切除，同时脱除侧链保护基得到曲普瑞林粗肽：pyr-his-trp-ser-tyr-d-trp-leu-arg-pro-gly-nh2；

10、(5)曲普瑞林粗肽经初步纯化、纯化换盐制得醋酸曲普瑞林纯品。

11、优选地，步骤(1)中，制备片段1～7的过程中，使用的氨基脱fmoc保护试剂为20％的哌啶的dmf溶液；偶联试剂为oxyma、hobt、hoat中的一种或其组合；活化剂为dic；步骤(1)中rink amide mbha：fmoc-gly-oh：偶联试剂：活化剂的投料摩尔比为1：2.4～3.6：2.4～3.6：3～3.6(后续偶联反应投料摩尔比与此相同，如rink amide mbha-gly-fmoc：fmoc-pro-oh：偶联试剂：活化剂＝1：2.4～3.6：2.4～3.6：3～3.6)；优选1：3：3.6：3.6。

12、优选地，步骤(2)中氨基酸n端保护为boc保护，反应条件为在碳酸钠作用下与boc酸酐反应，氨基酸：碳酸钠：boc酸酐的投料摩尔比为1：1.2～2.5：1.1～1.8；优选1：1.5：1.2。

13、优选地，步骤(2)中c端保护基r1和r2分别选自su和pnp中的一种，二者可以相同或不同；当r1或r2为su时，反应条件为以dcc为活化剂，与nhs反应，氨基酸与nhs、dcc的投料摩尔比为1：1.05～1.65：1.2～2.5，优选1：1.2：1.5；当r1或r2为pnp时，反应条件为以dcc为活化剂，与pnp反应，氨基酸与pnp、dcc的投料摩尔比为1：1.05～1.65：1.2～2.5，优选1：1.2：1.5。

14、在一实施方案中，步骤(2)中的氨基酸之间进行缩合时，加入羧基活化剂效果更好；羧基活化剂为碳酸氢钠，投料摩尔比为n/c端均被保护的氨基酸(如boc-pyr-coor1)：n/c端均无保护的氨基酸(如h-his(trt)-oh)：羧基活化剂＝1：1.05～1.5：1.2～2.5，优选1：1.1：1.5；

15、优选地，步骤(3)中所述偶联试剂选自oxyma、hobt、hoat中的一种或其组合；所述活化剂为dic。

16、优选地，步骤(3)中，使用的氨基脱fmoc保护试剂为20％的哌啶的dmf溶液；片段1～7和片段8～10、偶联试剂、活化剂的投料摩尔比为1：2.4～3.6：2.4～3.6：3～3.6；优选1：3：3.6：3.6。

17、优选地，步骤(4)中，肽从树脂上切除的裂解试剂为包含tfa、dtt、tips和h2o的混合溶液。

18、在一实施方案中，裂解试剂中tfa、dtt、tips和h2o的体积比为85～92：3～7：2～6：1～4，优选90：5：3：2。

19、优选地，步骤(5)中，初步纯化为高效液相色谱纯化，色谱柱为c18柱，流动相系统为0.02m磷酸二氢铵水溶液(ph2.5)和0.1％tfa/乙腈溶液。

20、优选地，步骤(5)中，纯化换盐为高效液相色谱纯化换盐，色谱柱为c18柱，流动相系统为1％醋酸/水溶液和甲醇。

21、在一实施方案中，固相法制备片段1～7的操作步骤如下：称取一定量rink amidembha树脂置于合成管中，加入dmf溶胀树脂，并以20％哌啶/dmf为脱保护试剂脱fmoc保护；称取fmoc-gly-oh、偶联试剂溶于dmf中，加入活化剂活化后，加入上述合成管中，以茚三酮法检测判断反应终点，制得fmoc-gly-树脂；所述偶联试剂、活化剂以及各反应物料的投料摩尔比如本发明上文所述；采用同样的方法依次偶联如下氨基酸单体fmoc-pro-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-d-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh，即可通过固相合成法制得全保护的曲普瑞林7肽树脂rink amide mbha-gly-pro-arg(pbf)-leu-d-trp(boc)-tyr(tbu)-ser(tbu)-fmoc。

22、在一实施方案中，制备boc-pyr-coor1的操作步骤如下：将h-pyr-oh与20％的丙酮水混匀，加入碳酸钠溶液和boc酸酐，反应制得boc-pyr-oh；将boc-pyr-oh溶于有机溶剂中，在活化剂dcc的作用下与nhs或pnp反应，制得boc-pyr-coosu或boc-pyr-coopnp；所述有机溶剂包括但不限于四氢呋喃、1,4-二氧六环；各反应物料的投料摩尔比如本发明上文所述。

23、在一实施方案中，液相法制备片段8～10的操作步骤如下：将h-his(trt)-oh和碳酸氢钠溶于水中，滴加到boc-pyr-coor1溶液中，制得boc-pyr-his(trt)-oh；boc-pyr-coosu与h-his(trt)-oh、碳酸氢钠的投料摩尔比各反应物料的投料摩尔比如本发明上文所述；参考boc-pyr-coor1制备中的羧基保护步骤制备boc-pyr-his(trt)-coor1；参考制备boc-pyr-his(trt)-oh中的氨基酸偶联步骤，将boc-pyr-his(trt)-coor1与h-trp(boc)-oh在碳酸氢钠作用下偶联boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh。

24、在一实施方案中，固相法将片段1～7和片段8～10偶联的操作步骤如下：将片段1～7置于合成管中，以20％哌啶/dmf为脱保护试剂脱fmoc保护；将boc-pyr-his(trt)-trp(boc)-oh、偶联试剂溶于dmf中，加入活化剂活化后，加入上述合成管中，以茚三酮法检测判断反应终点，制得曲普瑞林10肽树脂；所述偶联试剂、活化剂以及各反应物料的投料摩尔比如本发明上文所述。

25、在一实施方案中，曲普瑞林粗肽的初步纯化采用高效液相色谱梯度洗脱法，流动相以0.02m磷酸二氢铵水溶液(ph2.5)为流动相a，以0.1％tfa/乙腈为流动相b，洗脱梯度如下：

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27、在一实施方案中，曲普瑞林的纯化转盐采用高效液相色谱梯度洗脱法，流动相以1％醋酸/水溶液为流动相a，以甲醇为流动相b，洗脱梯度如下：

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29、本发明的有益效果：

30、本发明将固相合成与液相合成的优点相结合，用以合成高纯度的醋酸曲普瑞林，以65％的总收率制得醋酸曲普瑞林纯肽。将固相条件下易消旋的his、pyr采用液相合成，避免his、pyr的消旋，使得d-his2-曲普瑞林杂质显著减小，便于制备纯化且显著提高收率。整个工艺绿色高效，方法简便，便于工业化应用。