DMD基因拷贝数变异检测用的引物和探针及试剂盒的制作方法

本技术涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种dmd基因拷贝数变异检测用的引物和探针及试剂盒。

背景技术：

1、假肥大性肌营养不良症包含duchenen型肌营养不良症(dmd)和beacher型肌营养不良症(bmd)两种类型，二者均由于抗肌萎缩蛋(dys)基因突变所导致的x隐性遗传病。dmd/bmd患者dys缺乏主要导致了骨骼肌细胞膜缺陷，细胞内的肌酸激酶等外漏，肌细胞坏死、脂肪组织和纤维结缔组织增生。其中dmd是最为常见，发病率为1/3500活产男婴，患儿多呈明显家族性，另有1/3由新发突变致病。bmd致病基因与dmd相同，但发病率为dmd的十分之一，dmd基因的突变是导致假肥大性肌营养不良的主要原因。dmd基因片段的缺失、重复及拷贝数变异(copy number variation，cnv)和点突变(single nucleotide polymorphism，snp)均可导致该病，其中由于基因序列缺失和重复导致的dmd、bmd占比70％以上。由于该病缺乏特效的治疗方法，故通过对先证者的确诊、携带者的产前诊断和提供正确的遗传咨询以杜绝假肥大性肌营养不良症患儿的出生是降低本病发病率的关键措施。

2、目前针对dmd基因的cnv变异检测的方法主要有：多重连接探针扩增技术(mlpa)、微阵列比较基因杂交(array-cgh)、affymetrix cnv芯片技术及第二代基因测序技术等。其中arrat-cgh、affymetrix cnv芯片技术及二代测序主要用于全基因组的拷贝数变异检测，准确而高效，但是成本也相对较高；mlpa是目前为止针对dmd基因检测比较成熟的方式，通过一代测序平台实现基因拷贝数变异的检测，然而这种方法也存在一定的局限性，譬如对样本dna要求较高、检测通量较低、结果容易出现假阳性等。

3、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本技术的目的在于提供一种dmd基因拷贝数变异检测用的引物和探针及试剂盒，以解决现有技术中针对dmd基因的cnv变异检测方法存在的成本高、存在局限性、检测通量低、易出现假阳性等问题。

2、为实现上述目的，本技术采用的一个技术方案是：

3、提供一种dmd基因拷贝数变异检测用的引物和探针，

4、所述探针包括：

5、覆盖位于dmd基因的79个外显子上共170个目标位点的170个探针组，所述79个外显子上共170个目标位点的位置如说明书表1中no.1至no.170所示；

6、覆盖位于参照基因上至少一个目标位点的至少一个所述探针组；

7、其中，每一所述探针组包括分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补的5’端探针和3’端探针；

8、所述引物包括针对所述探针组的正向引物和反向引物。

9、在一个或多个实施方式中，每一所述5’端探针包括依次排列的第一通用引物结合位点、第一连接序列，每一所述3’端探针包括依次排列的第二连接序列和第二通用引物结合位点，其中，所述第一连接序列和所述第二连接序列分别与目标位点的5’端和3’端至少部分互补；

10、所述引物包括：

11、针对所述第一通用引物结合位点的第一通用引物组，包括至少一个第一通用引物，每一所述第一通用引物至少与一个所述5’端探针的所述第一通用引物结合位点至少部分互补；

12、针对所述第二通用引物结合位点的第二通用引物组，包括至少一个第二通用引物，每一所述第二通用引物至少与一个所述3’端探针的所述第二通用引物结合位点至少部分互补。

13、在一个或多个实施方式中，针对所述79个外显子的170个探针组的第一连接序列如seq id no.1～170所示，第二连接序列如seq id no.171～340所示。

14、在一个或多个实施方式中，所述探针还包括：

15、覆盖位于dmd基因上游的8个目标位点的8个探针组，所述dmd基因上游的8个目标位点的位置如说明书表1中no.171至no.178所示，针对dmd基因上游的8个探针组的第一连接序列如seq id no.341～348所示，第二连接序列如seq id no.349～356所示；

16、覆盖位于dmd基因的3’端非翻译区的1个目标位点的1个探针组，所述dmd基因的3’端非翻译区的1个目标位点的位置如说明书表1中no.179所示，针对3’端非翻译区的1个探针组的第一连接序列如seq id no.357所示，第二连接序列如seq id no.358所示；

17、覆盖位于dmd基因下游的2个目标位点的2个探针组，所述dmd基因下游的2个目标位点的位置如说明书表1中no.180至no.181所示，针对dmd基因下游的2个探针组的第一连接序列如seq id no.359～360所示，第二连接序列如seq id no.361～362所示。

18、在一个或多个实施方式中，所述探针还包括：

19、覆盖位于x染色体上的4个目标位点的4个探针组，所述x染色体上的4个目标位点的位置如说明书表1中no.182至no.185所示，针对x染色体的4个探针组的第一连接序列如seq id no.363～366所示，第二连接序列如seq id no.367～370所示；

20、覆盖位于y染色体上的4个目标位点的4个探针组，所述y染色体上的4个目标位点的位置如说明书表1中no.186至no.189所示，针对y染色体的4个探针组的5’端探针的第一连接序列如seq id no.371～374所示，第二连接序列如seq id no.375～378所示。

21、在一个或多个实施方式中，所述探针包括覆盖位于参照基因上的32个目标位点的32个探针组，所述参照基因的32个目标位点的位置如说明书表1中no.190至no.221所示，针对参照基因的32个探针组的第一连接序列如seq id no.379～410所示，第二连接序列如seq id no.411～442所示。

22、在一个或多个实施方式中，所述第一通用引物组包括四个第一通用引物，序列如seq id no.443～446所示，所述四个第一通用引物的5’端分别被不同荧光基团标记，所述第二通用引物组包括两个第二通用引物，序列如seq id no.447～448所示；

23、每一所述探针组的5’端探针的第一通用引物结合位点选自seq id no.449～452所示序列中的一个，每一所述探针组的3’端探针的第二通用引物结合位点选自seq idno.453～454所示序列中的一个。

24、为实现上述目的，本技术采用的另一个技术方案是：

25、提供一种dmd基因拷贝数变异检测用的试剂盒，包括

26、第一连接预混合液，包括4×gc solution和探针混合液，所述探针混合液包括上述任一实施方式所述的探针；

27、第二连接预混合液，包括10×taq缓冲液和taq连接酶；

28、连接反应终止液，包括edta；

29、pcr预混合液，包括10×pcr缓冲液、dntp、mgcl2、引物混合液和taq dna聚合酶，所述引物混合液包括上述任一实施方式所述的引物。

30、为实现上述目的，本技术采用的另一个技术方案是：

31、提供一种如上述任一实施方式所述的试剂盒的使用方法，包括：

32、将所述第一连接预混合液和样本dna混合，之后加入所述第二连接预混合液进行连接反应，以使所述探针连接至目标位点；

33、加入所述连接反应终止液；

34、加入pcr预混合液，进行pcr扩增；

35、将扩增后的pcr产物变性后进行毛细管电泳，将扩增片段分离，得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算。

36、在一个或多个实施方式中，所述探针包括若干探针group，每一所述探针group包括多个探针组，所述多个探针组包括至少一个针对dmd基因的检测探针组以及至少一个针对参照基因的参照探针组，且每一所述探针group的多个所述探针组对应于相同的正向引物和反向引物；

37、所述得到每个所述扩增片段的信息并进行拷贝数计算的步骤包括：

38、将所述探针group内的一检测探针组a对应的扩增片段的荧光峰高值除以同一探针group内的一参照探针组b对应的扩增片段的荧光峰高值，得到所述检测探针组a的r值；

39、将检测样本中所述检测探针组a的r值分别除以n个正常男性参照样本中所述检测探针组a的r值再乘以正常参照样本中所述检测探针组a的拷贝数，得到所述检测探针组a针对所述参照探针组b的n个校正拷贝数值，其中，所述检测样本为待检测dmd基因拷贝数的样本，所述正常男性参照样本为已知dmd基因拷贝数正常的男性样本；

40、当n大于1时，计算所述n个校正拷贝数值的平均值、标准方差及变异系数，若所述n个校正拷贝数值的变异系数小于10％，取所述n个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数；

41、若所述n个校正拷贝数值的变异系数大于10％，则依次剔除离所述n个校正拷贝数值的中位数最远的校正拷贝数值，直至剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，其中，m大于或等于2n/3，取所述m个校正拷贝数值的平均值作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数；

42、若不存在剩余的m个校正拷贝数值的变异系数小于5％，则取所述n个校正拷贝数值的中位数作为所述检测探针组a针对所述参照探针组b的相对拷贝数；

43、重复上述步骤，分别计算所述检测探针组a针对同一探针group内所有参照探针组的相对拷贝数，得到所述检测探针组a的i个相对拷贝数；

44、计算所述i个相对拷贝数的平均值、标准方差及变异系数，若所述i个相对拷贝数的变异系数小于10％，取所述i个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数；

45、若所述i个相对拷贝数的变异系数大于10％，则依次剔除离所述i个相对拷贝数的中位数最远的相对拷贝数，直至剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，其中，j大于或等于2n/3，取所述j个相对拷贝数的平均值作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数；

46、若不存在剩余的j个相对拷贝数的变异系数小于5％，则取所述i个相对拷贝数的中位数作为所述检测探针组a对应的扩增片段的拷贝数。

47、区别于现有技术，本技术的有益效果是：

48、本技术的引物和探针设计能够覆盖dmd基因的全部79个外显子，每个外显子上均至少覆盖有2个探针组，能够一次性对每个外显子的大片段缺失或重复进行检测，检测通量高；

49、本技术的试剂盒的使用方法流程简单，仅包括连接反应和pcr反应，整个流程总共不超过24小时，检测效率高；

50、本技术的试剂盒针对dmd基因的每个检测区域的连接产物采用通用引物进行扩增，扩增效率基本一致，同时还引入了多个参照基因位点进行数据校正计算，平均检测差异cv值小于10％，可保证检测结构的准备性；

51、本技术的试剂盒可基于一代测序平台完成检测，相比于二代测序平台检测技术有效降低了成本；

52、本技术可以对6拷贝以内的位点进行准确定量，分辨率高。