一种多肽偶联海藻酸钠水凝胶及其制备方法和应用与流程

本技术涉及细胞培养，特别是涉及一种多肽偶联海藻酸钠水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞3d培养，即三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture,tdcc)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。细胞3d培养的关键是用于细胞附着和生长的生物支架，原则上，生物支架必须具备适当的机械性能、良好的可附着性和很好的生物相容性。

2、海藻酸钠是一种天然生物高分子，具有良好的生物相容性，不会引发明显的免疫反应或毒性反应，适合用于细胞培养和组织工程等生物医学应用。由海藻酸钠制备的海藻酸钠水凝胶具有良好的渗透性能，可以促进氧气、营养物质和代谢产物的有效交换，有利于细胞的生长和功能表达；并且，海藻酸钠水凝胶的机械性能可以通过调整其浓度、交联程度和结构形态等参数进行调控；可以制备出各种强度、刚度和形状的水凝胶，以满足不同类型细胞的需求。海藻酸钠水凝胶表面带有负电荷，对许多细胞都具有良好的附着性，有利于细胞在凝胶内的定植和生长；而且海藻酸钠水凝胶还可以通过调整其流变特性，使其具备一定的可注射性，这种特性使得海藻酸钠水凝胶能够方便地注射到目标组织或体内。总之，用于细胞培养的海藻酸钠水凝胶具有良好的生物相容性、透气性、机械性能可调控、细胞可附着性和可注射性等优势，适用于细胞培养、组织工程和再生医学等领域。

3、但是，现有的海藻酸钠水凝胶或者基于海藻酸钠研发的凝胶产品，细胞增殖较慢，难以满足临床使用需求。因此，如何提高细胞增殖速度是海藻酸钠水凝胶的研究重点和难点。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一种改进的多肽偶联海藻酸钠水凝胶及其制备方法和应用。

2、本技术采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一种多肽偶联海藻酸钠水凝胶，该多肽偶联海藻酸钠水凝胶为多肽偶联的海藻酸钠形成的水凝胶。

4、需要说明的是，本技术在现有的海藻酸钠水凝胶基础上进行改进，具体的，在海藻酸钠上偶联多肽片段由此形成水凝胶，使得本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶，不仅保留了海藻酸钠生物相容性好、透气性好、机械强度可调、便于细胞吸附和可注射使用等优点；更重要的是，偶联多肽片段的海藻酸钠水凝胶，更利于细胞增殖，提高了细胞增殖速度。在本技术的一种实现方式中，本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶的细胞增殖速度相对于常规的海藻酸钠水凝胶，有极显著的差异性。可以理解，本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶不仅能够用于细胞3d培养，还能够用于细胞的扩增及保存。

5、本技术的一种实现方式中，多肽为seq id no.1至seq id no.6所示序列中的至少一种；

6、seq id no.1：gefyfdlrlkgdky；

7、seq id no.2：gyavtgrgdspas；

8、seq id no.3：gagtfalrgdnpqg；

9、seq id no.4：grkrlqvqsirt；

10、seq id no.5：gikvav；

11、seq id no.6：ggggyigsr。

12、优选的，多肽为seq id no.2或seq id no.5所示序列。

13、本技术的一种实现方式中，多肽偶联海藻酸钠水凝胶中每1g海藻酸钠含有80-120μmol多肽。

14、优选的，每1g海藻酸钠中含有100μmol多肽。

15、需要说明的是，以上具体配比只是本技术的一种实现方式中具体采用的最优多肽偶联海藻酸钠水凝胶配方，在该配比下能够获得更好的细胞增殖效果。可以理解，在此基础上，本领域技术人员可以根据实际情况调整配比，以获得不同的细胞增殖效果。

16、本技术的一种实现方式中，多肽偶联的海藻酸钠由多肽在含有2-(n-吗啉代)乙磺酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的海藻酸钠溶液中偶联获得。

17、本技术的第二方面公开了本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶的制备方法，包括将多肽偶联的海藻酸钠的水溶液与无机盐溶液混合，在无机盐溶液中交联形成本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶。

18、需要说明的是，本技术的制备方法中，无机盐溶液主要起到交联作用，即多肽偶联的海藻酸钠在无机盐溶液中进行交联，形成本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶。

19、本技术的一种实现方式中，多肽偶联的海藻酸钠由多肽加入含有2-(n-吗啉代)乙磺酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的海藻酸钠溶液中进行偶联反应获得。

20、本技术的一种实现方式中，偶联反应的时间为至少20h。

21、本技术的一种实现方式中，偶联反应后进行两天透析，然后向溶液中加入活性炭处理4h，用过滤器过滤去除活性炭，冻干即获得本技术的多肽偶联的海藻酸钠。

22、本技术的一种实现方式中，过滤器为0.45μm的过滤器。

23、本技术的一种实现方式中，无机盐溶液为氯化钙的水溶液。

24、本技术的第三方面公开了一种采用本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶的生物支架。

25、需要说明的是，本技术的生物支架，由于采用本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶，一方面，具有生物相容性好、透气性好、机械强度可调、便于细胞吸附和生长等优点；另一方面，细胞在本技术的生物支架上生长速度快，能够更好的满足临床使用需求。此外，由于本技术的生物支架上的细胞增殖速度快，也能够更好的满足不同的科研或试验需求，缩短试验时间，提高研发效率。

26、本技术的第四方面公开了采用本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶进行细胞3d培养的方法，包括将多肽偶联的海藻酸钠的水溶液、无机盐溶液，以及含有待培养细胞的培养基，按比例混合，在培养箱中静置培养至少1h，然后，添加培养基继续培养。

27、需要说明的是，本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶主要是为细胞提供一个三维立体空间结构，以便于细胞在其中迁移和生长，从而构成三维的细胞-载体复合物。其中，细胞培养所需的培养基，可以根据具体的细胞而定。在培养箱中静置培养至少1h是为了使得三维立体空间结构充分固定成形，至于后续添加培养基继续培养，可以参考现有的细胞培养方法，在此不做具体限定。

28、还需要说明的是，本技术的细胞3d培养方法，由于采用本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶，细胞增殖速度明显加快，提高了细胞3d培养的效率；并且，同时具有生物相容性好、透气性好、机械强度可调、便于细胞吸附和生长等优点。

29、本技术的一种实现方式中，多肽偶联的海藻酸钠的水溶液的浓度为0.1g/ml，无机盐溶液的浓度为100mmol/l，按照多肽偶联的海藻酸钠的水溶液:无机盐溶液:含有待培养细胞的培养基的体积比为6:6:18混合进行培养。

30、本技术的一种实现方式中，无机盐溶液为氯化钙的水溶液。

31、本技术的一种实现方式中，培养基为含有抗生素和fbs的dmem。例如，一般的胎牛血清(fbs)的用量为10％(v/v)。

32、需要说明的是，以上培养基只是本技术的一种实现方式中具体采用的培养基，根据所培养的细胞不同，具体的可以根据需求进行调整，例如，可以在培养基中添加不同的添加剂，以满足特定使用需求，在此不做具体限定。本技术使用的抗生素为青霉素和链霉素，例如采用50-100u青霉素，50-100μg链霉素。

33、本技术的有益效果在于：

34、本技术的多肽偶联海藻酸钠水凝胶，具有生物相容性好、透气性好、机械强度可调、可注射使用、便于细胞吸附和生长，且细胞增殖速度快等优点，能够更好的满足使用需求。