一种β-酪蛋白基因型检测方法及应用与流程

本发明属于基因工程，尤其是涉及一种β-酪蛋白基因型检测方法及应用。

背景技术：

1、牛奶是日常饮食中最常见的蛋白来源，在牛奶中主要有2种蛋白：酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白大约占牛奶蛋白的80%，乳清蛋白约占14%。牛奶中的酪蛋白又主要包括4种：alpha s1-酪蛋白、alpha s2-酪蛋白、beta-酪蛋白和kappa-酪蛋白，其中beta-酪蛋白约占酪蛋白含量的25-35%。

2、由于基因突变，已知的beta-酪蛋白主要有11种型号，分别是a1，a2， a3，b， c， d，e， f， h， i， g。其中a3和c型比较罕见。牛奶中最常见的型号是a1和a2型，b型次之。a1和a2型的beta-酪蛋白最主要的区别是a2型beta-酪蛋白氨基酸链上第67位的脯氨酸被a1型beta-酪蛋白中的组氨酸代替，这导致a1和a2型beta-酪蛋白在二级结构上存在差异，这个差异使a1在消化过程中可生成beta-酪啡肽-7（bcm-7），而a2 则不会生成。很多研究表明，bcm-7与部分婴儿的1型糖尿病风险升高、免疫反应、消化功能紊乱,孤独症和呼吸功能障碍之间存在关联。另有研究表明，在所有酪蛋白的种类中，a2型beta-酪蛋白配制成的奶粉与母乳最为接近，营养价值也更高。因此，能够找到一种快速、批量、精准的区分beta-酪蛋白型号的方法很有必要。

3、目前存在的一些通过测序的检测方法主要包括传统的sanger测序和illumina等二代测序的方法，但是它们都表现出测序自身的一些缺点，主要表现在：sanger测序不仅耗时耗力，而且通量较低；由于测序技术的发展，illumina测序在通量上有质的提高，但是读长较短。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种β-酪蛋白基因型检测方法及应用。

2、本发明采用的技术方案是：一种β-酪蛋白基因型检测方法，以β-酪蛋白基因为检测对象，设计含有不同标签序列的正反向引物；使用含有不同标签序列的引物分别对多个待测样本进行pcr扩增，将扩增产物混合后制备得到检测文库，通过三代测序对检测文库进行测序，得到多个待测样本的序列信息，以标签序列为依据划分每个待测样本序列信息，分析序列信息可知待测样本基因型。

3、优选地，具体步骤如下：

4、步骤一：以β-酪蛋白基因为检测对象，设计正反向的基础引物；将不同的标签序列分别加在基础引物的前端和/或后端形成扩增引物；

5、步骤二：通过n个不同的的扩增引物分别对n个待测样本进行pcr扩增；

6、步骤三：将步骤二中的扩增产物混合，纯化后得到检测文库；

7、步骤四：将检测文库通过三代测序技术进行测序，获得总序列信息；

8、步骤五：根据标签序列信息在总序列信息中划分各个待测样本序列信息；

9、步骤六：比对测得的序列信息，获知待测样本β-酪蛋白基因型。

10、优选地，以β-酪蛋白基因7号外显子基因为检测对象，序列如seq id no.1所示；引物中包括如seq id no.2所示序列或如seq id no.3所示序列。

11、优选地，一个扩增引物包括一个或两个标签序列；当一个扩增引物包括两个标签序列时，两个标签序列都在基础引物5’前端，或两个标签序列都在基础引物3’后端，或者两个标签序列分别在5’前端和3’后端。

12、优选地，标签序列长度为10-20bp，当一个扩增引物包括两个标签序列时，不同扩增引物所包含的两个标签序列都不相同，或者，全部的或者部分的扩增引物包含一个相同的标签序列和一个不同的标签序列。

13、优选地，对步骤二制备得到扩增产物进行定量检测，在步骤三中，将扩增产物等量混合。

14、优选地，步骤三中纯化过程采用磁珠纯化法。

15、优选地，步骤六中，对比测得序列信息的方法包括比对不同待测样本序列信息，和/或比对已知型号突变型序列信息与待测样本序列信息。

16、β-酪蛋白基因型检测方法在鉴定奶牛基因型中的应用。

17、优选地，以a2型β-酪蛋白为参考，识别出待测样本序列信息中的变异位点，判断待测样本基因型

18、本发明具有的优点和积极效果是：将第三代测序（pacbio rs ii）作为一种新的测序方法应用于β-酪蛋白型号鉴定中，其测序通量高（平均每个smrt cell中可产生70,000条有效序列），测序周期短（一个cell的产出仅需2-3h），并且读长长（平均读长可达到10kb左右）；

19、在进行识别不同型号beta-酪蛋白核苷酸序列的变异位点中无需组装，可直接获得完整的外显子或整个基因序列，这无论在识别变体的准确性上，还是效率上都有了很大的提高。

技术特征：

1.一种β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：以β-酪蛋白基因为检测对象，设计含有不同标签序列的正反向引物；使用含有不同标签序列的引物分别对多个待测样本进行pcr扩增，将扩增产物混合后制备得到检测文库，通过三代测序对检测文库进行测序，得到多个待测样本的序列信息，以标签序列为依据划分每个待测样本序列信息，分析序列信息可知待测样本基因型。

2.根据权利要求1所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

3.根据权利要求1或2所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：以β-酪蛋白基因7号外显子基因为检测对象，序列如seq id no.1所示；引物中包括如seq id no.2所示序列或如seq id no.3所示序列。

4.根据权利要求2所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：一个扩增引物包括一个或两个标签序列；当一个扩增引物包括两个标签序列时，两个标签序列都在基础引物5’前端，或两个标签序列都在基础引物3’后端，或者两个标签序列分别在5’前端和3’后端。

5.根据权利要求4所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：标签序列长度为10-20bp，当一个扩增引物包括两个标签序列时，不同扩增引物所包含的两个标签序列都不相同，或者，全部的或者部分的扩增引物包含一个相同的标签序列和一个不同的标签序列。

6.根据权利要求2所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：对步骤二制备得到扩增产物进行定量检测，在步骤三中，将扩增产物等量混合。

7.根据权利要求2所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：步骤三中纯化过程采用磁珠纯化法。

8.根据权利要求2所述的β-酪蛋白基因型检测方法，其特征在于：步骤六中，对比测得序列信息的方法包括比对不同待测样本序列信息，和/或比对已知型号突变型序列信息与待测样本序列信息。

9.权利要求1-8中任一所述的β-酪蛋白基因型检测方法在鉴定奶牛基因型中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：以a2型β-酪蛋白为参考，识别出待测样本序列信息中的变异位点，判断待测样本基因型。

技术总结
本发明涉及一种β‑酪蛋白基因型检测方法及应用，涉及含有不同标签序列的扩增引物，扩增得到带有标签信息的DNA产物，依托三代测序平台（PacBio RS II），针对多个待检测奶牛的DNA，以其beta‑酪蛋白基因序列为研究对象，通过序列比对进行变异位点识别，根据已知的不同beta‑酪蛋白型号的序列从而判定待检测奶牛的beta‑酪蛋白基因型。本发明方法能够批次、高效地进行检测奶牛中beta‑酪蛋白基因型，可一次批量检测出上百份材料中的基因型，并且数据可靠，具有通量高、成本低，检验精确等优势。

技术研发人员：孙亚民,王龙
受保护的技术使用者：允思拓（天津）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15