一种胞外多糖基水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种胞外多糖基水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、皮肤是人体中表面积最大的器官，它是保护内部组织免受机械损伤、微生物感染、紫外线辐射和极端温度的关键结构。这使得其极易受到损伤，对个体患者和医疗保健经济都有重大影响。在日常生活中皮肤很容易受到各种损伤形成伤口，一旦皮肤受损，就为有害细菌侵入活组织提供了机会，从而打破皮肤微生物系统的平衡，导致伤口感染，严重的甚至是组织损伤。而涉及真皮甚至更深组织损伤的伤口难以愈合，且可能会出现严重的疤痕。

2、水凝胶因其温和的加工条件和结合许多生物活性剂的能力，为伤口敷料提供了巨大的优势。天然材料，如多糖和蛋白质，是用于制造皮肤模拟水凝胶的理想材料。作为最主要的天然聚合物之一，多糖具有良好的生物相容性，并且具有丰富的官能团，如羟基、羧基、胺基团，可进行多种化学改性，并具有较高的保水能力。纤维素、壳聚糖、淀粉、海藻酸钠、卡拉胶、透明质酸、肝素和右旋糖酐已被广泛探索用于伤口敷料应用。胞外多糖是微生物在生长与代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖。由于胞外多糖分子结构和官能团的差异，可以产生具有不同特性的水凝胶，甚至可以通过自组装现象产生纳米颗粒。除了具有生物相容性和可生物降解的特性外，胞外多糖还具有高度亲水性，通常在水中形成假塑性溶液，这些流变特性使其成为医疗、化妆品、食品等领域的优良候选材料。

3、水凝胶是一种新型的生物材料，因其具有良好的生物相容性、可调控的物理化学性质以及较高的生物活性而备受关注。然而，研究表明，现有的一些水凝胶容易引起免疫排斥反应，这主要是由于其化学成分、物理性质和微结构等方面与人体组织的相容性存在差异所导致的。免疫排斥反应不仅可能导致水凝胶在体内的降解和吸收过程受到阻碍，还可能导致组织炎症反应和免疫系统的激活，从而对患者的健康造成不利影响。因此，为了进一步提高水凝胶的生物相容性，需要在材料的设计、制备和应用等方面进行深入的研究和优化。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种胞外多糖基水凝胶及其制备方法和应用，以改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖为原料制备水凝胶，旨在得到一种有良好的机械性能和生物相容性的水凝胶。将其应用于皮肤全层损伤模型中，可显著促进皮肤附属器官的形成，从而加速伤口愈合。

2、为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

3、一种胞外多糖基水凝胶，用改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖和改性后的透明质酸钠为原料，构建水凝胶体系；所述的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖采用多巴胺改性，所述的透明质酸钠用甲基丙烯酸酐改性。

4、进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖的改性为磷酸盐缓冲液和贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(m76-eps)，充分搅拌溶解，得到混合溶液，然后将碳二亚胺(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解在上述混合溶液中，充分搅拌并溶解，调节ph至5.5，持续搅拌30min；再加入盐酸多巴胺(da)，充分搅拌溶解，持续搅拌反应4h，然后透析，冷冻干燥后得到多巴胺改性的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(76da)。

5、进一步地，所述磷酸盐缓冲液的体积为50ml(ph值为5.5)；所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(m76-eps)用量为500mg，碳二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)以及盐酸多巴胺(da)的添加量均为2.5mmol；所述使用规格为8000-14000da的透析袋，用去离子水透析48h。

6、进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖的提取方法，包含以下操作步骤：

7、(1)菌种活化：将保藏号为gdmcc no：61384且保藏于4℃冰箱中的bacillusvelezensis m76t11b在mrs平板上进行三区划线活化菌株，37℃恒温条件下，静置培养48h后挑取生长状态良好的单菌落接种至mrs肉汤中，37℃、150rpm培养16h；

8、(2)扩大培养：将在mrs肉汤中培养后的菌株以5％(v/v)接种量接种到1000mlmrs-s液体培养基中，在37℃、150rpm条件下摇床培养48h，即得发酵液；

9、(3)粗多糖的沉淀：取发酵液经4℃、10,000×g离心20min去除菌体沉淀，取上清液浓缩到原体积1/5加入4倍体积的4℃体积浓度95％乙醇至终浓度为80％，搅拌均匀，4℃静置过夜沉淀多糖，在4℃、10,000×g离心20min获得多糖沉淀；

10、(4)脱蛋白：将多糖沉淀溶于去离子水中，加入80％(m/v)的三氯乙酸至终浓度4％(m/v)，搅拌均匀4℃静置10h后在4℃下10,000×g离心20min弃去蛋白沉淀，收集上清液；

11、(5)多糖的二次醇沉：将上清液浓缩，加入4倍体积的95％乙醇至终浓度为80％，在4℃下静置过夜以沉淀多糖，过滤，收集多糖沉淀，将多糖沉淀重新溶解于去离子水中，装入透析袋(截留分子量8000-14000da)透析48h，每隔8h换水，将透析后的糖溶液冷冻干燥，即得贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(m76-eps)。

12、进一步地，所述透明质酸钠的改性为将透明质酸钠(ha)溶于去离子水中，调节溶液的ph值为8，加入甲基丙烯酸酐(ma)，在室温下搅拌12h，再通过乙醇(体积浓度80％)沉淀得到hama粗产物，并用无水乙醇洗涤三次以去除剩余的甲基丙烯酸酐和反应过程中产生的甲基丙烯酸，然后透析48h，冷冻干燥得到hama，即改性后的透明质酸钠。

13、进一步地，所述透明酸钠(ha)与去离子水按照质量比1:100混合；加入4.8ml甲基丙烯酸酐；然后使用规格为8000-14000da的透析袋，用去离子水透析48h。

14、如上所述胞外多糖基水凝胶的制备方法为将改性后的透明质酸钠(hama)和改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(76da)溶于lap溶液中，405nm光交联30s得胞外多糖基水凝胶(hama-76da水凝胶)。

15、进一步地，hama、贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(76da)和蓝光引发剂lap溶液之间的质量比为1:2:100；所述lap溶液质量浓度为0.25％；即将50mg hama和100mg 76da溶于5ml浓度为质量浓度为0.25％的lap溶液中。

16、如上所述胞外多糖基水凝胶在促进皮肤伤口愈合药物方面的应用。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果：

18、本发明使用改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖构建水凝胶网络，该水凝胶机械性能良好，具有优良的生物相容性，对皮肤伤口愈合有较好的促进作用；进一步地本发明胞外多糖基水凝胶易于制备，合成方法简单，生产成本低。

19、保藏信息说明

20、bacillus velezensis m76t11b于2020年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no：61384。

技术特征：

1.一种胞外多糖基水凝胶，其特征在于：用改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖和改性后的透明质酸钠为原料，构建水凝胶体系；所述的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖采用多巴胺改性，所述的透明质酸钠用甲基丙烯酸酐改性。

2.根据权利要求1所述胞外多糖基水凝胶，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖的改性为磷酸盐缓冲液和贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖，充分搅拌溶解，得到混合溶液，然后将碳二亚胺，n-羟基琥珀酰亚胺溶解在上述混合溶液中，充分搅拌并溶解，调节ph至5.5，持续搅拌；再加入盐酸多巴胺，充分搅拌溶解，持续搅拌反应4h，然后透析，冷冻干燥后得到多巴胺改性的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖。

3.根据权利要求2所述胞外多糖基水凝胶，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的体积为50ml；所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖用量为500mg，碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺以及盐酸多巴胺的添加量均为2.5mmol；所述使用规格为8000-14000da的透析袋，用去离子水透析48h。

4.根据权利要2所述胞外多糖基水凝胶，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖的提取方法，包含以下操作步骤：

5.根据权利要1所述胞外多糖基水凝胶，其特征在于：所述透明质酸钠的改性为将透明质酸钠溶于水中，调节溶液的ph值为8，加入甲基丙烯酸酐，在室温下搅拌，再通过乙醇沉淀得到hama粗产物，并用无水乙醇洗涤，然后透析，冷冻干燥得到hama，即改性后的透明质酸钠。

6.根据权利要5所述胞外多糖基水凝胶，其特征在于：所述透明酸钠与水按照质量比1:100混合；加入4.8ml甲基丙烯酸酐；然后使用规格为8000-14000da的透析袋，用水透析48h。

7.如权利要求1-6任一所述胞外多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于：将改性后的透明质酸钠和改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖溶于的lap溶液中，405nm光交联得胞外多糖基水凝胶。

8.根据权利要求7所述胞外多糖基水凝胶的制备方法，其特征在于：hama、贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖(76da)和lap溶液之间的质量比为1:2:100；所述lap溶液的质量浓度为0.25％。

9.如权利要求1-6或8任一所述胞外多糖基水凝胶在促进皮肤伤口愈合药物方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种胞外多糖基水凝胶，用改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖和改性后的透明质酸钠为原料，构建水凝胶体系；所述的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖采用多巴胺改性，所述的透明质酸钠用甲基丙烯酸酐改性；以及给出了胞外多糖水凝胶的制备方法和应用。本发明使用改性后的贝莱斯芽孢杆菌胞外多糖构建水凝胶网络，该水凝胶机械性能良好，具有优良的生物相容性，对皮肤伤口愈合有较好的促进作用；进一步地本发明胞外多糖基水凝胶易于制备，合成方法简单，生产成本低。

技术研发人员：高洁,徐鸿涛,刘登鸿,周刘洋,于文清,李雅倩
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11