一种具有抗炎活性的类弹性融合蛋白TRX1-ELPs及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及一种具有抗炎活性的类弹性融合蛋白trx1-elps及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人硫氧还蛋白1(human thioredoxin 1，htrx1)是一种广泛存在于生物体内的小分子蛋白，具有多种生物学功能。htrx1的结构与其他硫氧还蛋白家族成员相似，包括一个硫氧还蛋白结构域(thioredoxin domain)和一个硫氧还蛋白还原酶结构域(thioredoxinreductase domain)。其中，硫氧还蛋白结构域负责催化氧化还原反应，而硫氧还蛋白还原酶结构域则参与底物的识别和结合。htrx1可以抑制nf-κb信号通路的激活，从而减少炎症相关基因的表达。此外，htrx1还可以促进抗炎细胞因子il-10的产生，并抑制促炎细胞因子il-1β、il-6等的产生，从而减轻炎症反应。

2、目前，将聚乙二醇(peg)与蛋白质偶联以形成蛋白质-peg偶联物是延长蛋白药物半衰期的常用方法，然而，传统的蛋白质-高分子偶联技术例如聚乙二醇化，仍然存在着一些难以避免的缺陷。例如：(1)蛋白质表面有许多无规分布的氨基、羧基、羟基以及其它反应性基团，难以位点特异性(定点)修饰，导致聚乙二醇化的产物为位点异构体混合物，蛋白质生物活性降低；(2)蛋白质与聚乙二醇之间的空间位阻效应导致聚乙二醇化效率低；(3)聚乙二醇是一种结构与功能简单的惰性的水溶性高分子，难以满足复杂的生物医药需求，如生物可降解性、刺激响应性和自组装性；(4)聚乙二醇存在潜在的免疫原性可能会影响其临床疗效；(5)聚乙二醇无法生物降解，可能导致体内生物蓄积。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的类弹性融合蛋白trx1-elps及其制备方法和应用。本发明将酿酒酵母作为载体，将trx1-elp60基因导入酿酒酵母，构建重组酿酒酵母工程菌，并经诱导培养后收集收集上清液，经过滤、纯化得到trx1-elp60融合蛋白，炎症因子检测结果显示，融合elp60可以显著提高重组trx1蛋白的半衰期，进而提高trx1抗炎效果，通过lps诱导的raw264.7巨噬细胞促炎分化模型试验，该重组融合蛋白能长时间抑制lps诱导的巨噬细胞分泌tnf-α和il-6水平，从而发挥炎症调节作用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、本发明提供的trx1-elps融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、本发明提供的编码所述trx1-elps融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqid no:2所示。

5、本发明还提供了含有所述基因的表达载体。

6、本发明还提供了含有所述基因的基因工程菌。

7、本发明提供的所述的trx1-elps融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将本发明所述的表达载体电转化至酿酒酵母invscl感受态细胞中，培养后获得基因工程菌，基因工程菌经诱导培养后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

8、所述制备方法包括以下步骤：

9、(1)通过linker将trx1与elps的目的基因连接起来，连接后的核苷酸序列表如seqid no:2所示；

10、(2)将连接后的目的基因连接到pyes2/ct-mfα质粒上获得表达载体；

11、(3)将表达载体电转化至酿酒酵母invscl感受态细胞中，培养，即可得到基因工程菌invsc1/pyes2/ct-mfα/trx1-elps；酿酒酵母在医药和食品工业中是公认的安全微生物体，其生化和遗传研究已经非常详细。酿酒酵母分泌表达系统为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性；

12、(4)基因工程菌经诱导培养后离心收集上清液，经过滤、纯化得到trx1-elps融合蛋白。

13、所述trx1的核苷酸序列如seq id no:3所示，其根据pyes2载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性设计得到。

14、所述elps为elp60；所述elp60的核苷酸序列如seq id no:4所示。

15、所述linker的核苷酸序列如seq id no:5所示。

16、步骤(4)中，诱导培养所使用的培养基为sc-u诱导培养基。

17、本发明还提供了所述trx1-elps融合蛋白在制备抗炎药物、抗氧化药物、化妆品或护肤品中的应用。

18、本发明根据pyes2载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性设计得到了trx1基因，并通过linker将其与elp60连接得到trx1-elp60基因，并将其与pyes2/ct-mfα质粒连接构建表达载体，然后将表达载体电转化至酿酒酵母invscl感受态细胞中，培养后获得基因工程菌，基因工程菌经诱导培养后收集上清液，经过滤、纯化得到trx1-elp60融合蛋白，其可以有效的提高重组蛋白trx1的稳定性，有效延长trx1的体内半衰期。体外试验证明trx1-elp60能显著抑制raw264.7巨噬细胞il-6和tnf-α分泌水平，且在体外作用时间更长，显著优于地塞米松处理效果。动物临床试验数据可知，在基础治疗方案前提下，使用trx1-elp60抗炎因子辅助治疗对于病毒病的治疗显著优于使用传统抗炎药物地塞米松。

技术特征：

1.trx1-elps融合蛋白，其特征在于，所述trx1-elps融合蛋白的氨基酸序列如seq idno:1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的trx1-elps融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。

3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。

5.根据权利要求1所述的trx1-elps融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述trx1的核苷酸序列如seq id no:3所示。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述elps为elp60；所述elp60的核苷酸序列如seqid no:4所示。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，诱导培养所使用的培养基为sc-u诱导培养基。

10.如权利要求1所述的trx1-elps融合蛋白在制备抗炎药物、抗病毒药物、化妆品或护肤品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有抗炎活性的类弹性融合蛋白TRX1‑ELPs及其制备方法和应用，将酿酒酵母作为载体，将TRX1‑ELP<subgt;60</subgt;基因导入酿酒酵母，构建重组酿酒酵母工程菌，并经诱导培养后收集收集上清液，经过滤、纯化得到TRX1‑ELP<subgt;60</subgt;融合蛋白，其可以显著改善重组TRX1蛋白的半衰期，进而提高TRX1抗炎效果，通过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞促炎分化模型试验，重组类弹性融合蛋白能长时间抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF‑α和IL‑6水平，从而发挥炎症调节作用。

技术研发人员：赵俊,许高涛,李增,朱何龙,刘家炉,孙同同,凡玉芳,何志远,周炜
受保护的技术使用者：芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24