一种亲本植酸酶变体的制作方法

本发明涉及蛋白质工程。更具体地，涉及一种亲本植酸酶变体。

背景技术：

1、植酸酶(phytase)，又称为肌醇六磷酸酶，属于正磷酸单酯磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(磷酸盐)的酶类总称。植酸在谷物、豆类、油料等作物种子中含量最为丰富，高达1％～3％，占植物总磷含量的60％～80％。但植酸中的磷不能被直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。研究表明，单胃动物(猪、鸡、鸭、鹅等)因为缺乏植酸酶而对植酸中磷的利用率很低。同时，植酸的强烈电负性导致其通常与二价或三价阳离子，如ca2+、zn2+、fe2+等形成不溶性盐类，阻碍小肠对矿物质的吸收。还会与蛋白质，氨基酸以及脂肪酸等形成络合物，影响他们的吸收利用。植酸还会与胃蛋白酶、胰凝乳酶、胰蛋白酶等结合，降低消化酶活性。因此，在单胃动物饲料中添加植酸酶可提高动物饲料中磷的利用率，降低动物排泄物中的磷含量，同时能提高蛋白和饲料的能量利用率。

2、植酸酶作为饲料添加剂预先加入饲料原料中，经高温制粒等过程(70-95度，时间为30秒-120秒)后，生产出饲料用于动物饲养。植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能满足饲料及饲料加工的要求，成为制约植酸酶推广应用的重要限制性因素之一。鉴于植酸酶对提高畜牧业生产效益和降低磷对环境的污染有重要意义，提高植酸酶的耐热性成为科研领域研究的新热点。

3、采用包衣技术可以有效降低植酸酶在制粒等高温高湿处理过程中的活性损失，大大提高植酸酶的利用效率。国内外均已针对植酸酶的包衣进行研究且取得了一定进展，著名的酶制剂生产商novozymes和basf开发的植酸酶包衣工艺，包衣的植酸酶与未经包衣的植酸酶酶粉相比，其热稳定性得到大幅度提升。专利wo2007044968、cn1981597 a、cn101168734a均公开了植酸酶的包衣工艺。虽然包衣工艺可以显著提升植酸酶的耐热性能，但是包衣的工艺复杂，同时还会延长植酸酶的生产周期，大大增加植酸酶的生产成本。

4、此外，通过蛋白质工程的方法在野生型植酸酶的氨基酸序列基础上，对特定位置的氨基酸进行突变，也可以筛选获得耐热性能优异的植酸酶。专利wo2019228441a1、us9605245、ep2102334b1等均对植酸酶进行了特定氨基酸的定点突变，使最终获得的植酸酶产品相较于野生型植酸酶的耐热性能有所提升。但是在饲料高温制粒过程中，这些植酸酶产品的酶活仍然会大量损失。

5、因此，还需要在现有研究的基础上开发耐热性能更为优异的植酸酶产品。

技术实现思路

1、具体地，本发明涉及如下各项：

2、1、一种亲本植酸酶变体，其特征在于，包括：

3、(a)所述变体相对于其亲本植酸酶，在对应于seq id no:1的第295位、第349位、第374位上具有一个或多个氨基酸的取代，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与seq id no:98相比，具有至少80％的序列一致性；

4、(b)所述变体具有植酸酶活性；并且

5、(c)与亲本植酸酶相比，所述变体具有增加的热稳定性。

6、2、项1所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列与seqid no:98相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。

7、3、根据项2所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述亲本植酸酶的氨基酸序列选自：seq id no:2、seq id no:98、seq id no:102、seq id no:107、seq id no:112或seq idno:115。

8、4、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第295位的氨基酸被取代为p、y、g、k、l或q；优选地，被取代为p或y。

9、5、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第349位的氨基酸被取代为选自k、l、g、h、r或t；优选地，被取代为k或l。

10、6、根据项3所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体在第374位的氨基酸被取代为选自r、v、n、s、t、f、k、p或y；优选地，被取代为r或v。

11、7、根据项1-6中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体相对于其亲本植酸酶，包含选自下组的氨基酸取代：

12、t295p；q349k；e374r；t295y；q349l；e374v；

13、t295p+q349k；t295p+e374r；t295p+q349l；t295p+e374v；

14、t295y+q349k；t295y+e374r；t295y+q349l；t295y+e374v；

15、q349l+e374r；q349k+e374r；q349l+e374v；q349k+e374v；

16、t295p+q349k+e374r；t295y+q349k+e374r；

17、t295p+q349l+e374r；t295y+q349l+e374r；

18、t295p+q349k+e374v；t295y+q349k+e374v；

19、t295p+q349l+e374v；t295y+q349l+e374v。

20、8、根据项7所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体与其亲本植酸酶的氨基酸序列相比，具有至少90％的序列一致性；优选的，具有至少95％的序列一致性；更优选的，具有至少98％的序列一致性。

21、9、根据项1-8中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体还进一步包括至少一对引入的二硫键。

22、10、根据项9所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体包括在与seq id no:1的第346位对应的位置上的氨基酸残基、以及与seq id no:1的第393位对应的位置上的氨基酸残基之间形成二硫键。

23、11、根据项1-10中任一项所述的亲本植酸酶变体，其特征在于，所述变体的氨基酸序列选自seq id no:99、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:109、seq id no:110、seq idno:111、seq id no:113、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:117或seq id no:118。

24、12、一种核酸，其编码如项1-11中任一项所述的亲本植酸酶变体。

25、13、一种载体，其包含如项12所述的核酸。

26、14、一种宿主细胞，其包含项13所述的载体。

27、15、项14所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞。

28、16、项15所述的宿主细胞，其为真菌细胞，所述真菌细胞选自毕赤酵母细胞或者黑曲霉细胞。

29、17、一种如项1-11中任一项所述的亲本植酸酶变体的生产方法，其特征在于，该方法包括：

30、(a)在适于所述亲本植酸酶变体表达的条件下，对项14-16中任一项所述的宿主细胞进行培养；

31、(b)回收该亲本植酸酶变体。