一种X性连锁鱼鳞病检测方法及其试剂盒

本发明涉及生物检测，尤其是利用数字pcr技术对sts基因拷贝数进行检测，用于x-性连锁鱼鳞病的检测及相关基因携带人群的筛查。

背景技术：

1、x-连锁鱼鳞病为x染色体连锁隐性遗传性鱼鳞病的重要类型，又称隐形遗传x-连锁鱼鳞病(recessive x-linked ichthyosis，xli)、类固醇硫酸酯酶缺乏症(steroidsulfatase deficiency)、黑鱼鳞病，该病主要发生于男性，仅由异性合子的母亲传给男性胎儿，女性仅属携带者发病极少。全球范围男性新生儿发病率约1/2 000～1/9 500。常于出生时或出生后不久发病，表现为全身皮肤干燥、粗糙、黑褐色鳞屑，主要累及肢体伸侧和躯干侧面，颈部、面及耳部。

2、目前对x-连锁鱼鳞病的发病机制有较深入的研究，是由编码类固醇硫酸盐的类固醇硫酸酯酶基因(sts)的缺失或突变引起的遗传病，该基因位于xp22.31，共有10个外显子，编码类固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase，sts)。sts广泛分布于包括胎盘、皮肤、阴道、乳腺、血液、肝脏、脑等人体各组织器官，并被证实与xli的发病机制相关。

技术实现思路

1、本发明在于提供一种基于微滴数字pcr(ddpcr)的引物探针组合及试剂盒，用于sts基因拷贝数检测。为x-连锁鱼鳞病的检测或sts拷贝数变异携带者的筛查的提供一种灵敏度高、特异性强、检测通量高、检测流程快速便捷的检测方法。

2、一方面，本发明提供了一组引物探针组合，所述的引物探针组合包括检测sts基因第一外显子扩增和检测组合pcr_exon1_f(seq id no:1)、pcr_exon1_r(seq id no:2)和probe_exon1(seq id no:3)；第二外显子扩增和检测组合pcr_exon2_f(seq id no:4)、pcr_exon2_r(seq id no:5)和probe_exon2(seq id no:6)；第三外显子扩增和检测组合pcr_exon3_f(seq id no:7)、pcr_exon3_r(seq id no8)和probe_exon3(seq id no:9)；第四外显子扩增和检测组合pcr_exon4_f(seq id no:10)、pcr_exon4_r(seq id no:11)和probe_exon4(seq id no:12)；第五外显子扩增和检测组合pcr_exon5_f(seq id no:13)、pcr_exon5_r(seq id no:14)和probe_exon5(seq id no:15)；第六外显子扩增和检测组合pcr_exon6_f(seq id no:16)、pcr_exon6_r(seq id no:17)和probe_exon6(seq id no:18)；第七外显子扩增和检测组合pcr_exon7_f(seq id no:19)、pcr_exon7_r(seq id no:20)和probe_exon7(seq id no:21)；第八外显子扩增和检测组合pcr_exon8_f(seq id no:22)、pcr_exon8_r(seq id no:23)和probe_exon8(seq id no:24)；第九外显子扩增和检测组合pcr_exon9_f(seq id no:25)、pcr_exon9_r(seq id no:26)和probe_exon9(seq idno:27)；第十外显子扩增和检测组合pcr_exon10_f(seq id no:28)、pcr_exon10_r(seq idno:29)和probe_exon10(seq id no:30)；所述引物探针涉及sts基因(genbank登录号：ng_021472.2)10个外显子区域，具体序列如下表一所示：

3、表一sts基因外显子检测引物探针组合及序列表

4、

5、

6、在一些实施例中，根据不同型号数字pcr仪的荧光通道数，可以从上述10组外显子检测引物探针组合中任意选择1种，或2种，或3种，或4种，或5种外显子扩增检测引物探针组合。

7、另一方面，本发明还提供了用于人内参基因rpp40的扩增和检测，包括：pcr_rpp40_f(seq id no:31)、pcr_rpp40_r(seq id no:32)和probe_rpp40(seq id no:33)，具体序列如下表二所示。以rpp40的检出数量作为参考对象可以计算出sts基因外显子的拷贝数。

8、表二rpp40基因外显子检测引物探针组合及序列表

9、 序列编号 序列名称 核苷酸序列 seq id no:31 pcr_rpp40_f cagcgtaatctgcctaaa seq id no:32 pcr_rpp40_r gcttcctatcctccaaaa seq id no:33 probe_rpp40 acaccataattcctgatgacttgatcc

10、另一方面，本发明提供了一种试剂或试剂组合，其包含前述
技术实现要素：
中的引物探针和/或其组合。

11、另一方面，本发明提供了一种用于sts基因的拷贝数检测的试剂盒，其包含前述试剂或试剂组合及数字pcr反应预混液。

12、在一些优选的实施例中，所述数字pcr反应预混液，包括：buffer、mg2+、dntps、热启动taq酶中的一种或多种。

13、另一方面，本发明提供了一种x连锁鱼鳞病或其携带人群的筛查方法：首先，使用核酸抽提试剂对样本进行dna抽提；其次用前述发明方案中的检测试剂或试剂盒对sts基因外显子以及内参基因进行数字pcr检测；然后根据ts基因外显子以及内参基因的比值确定sts基因的拷贝数，进而对x连锁鱼鳞病或其携带人群进行风行评估。

14、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：

15、1、sts基因全长约136kb，基因片段长度长，外显子数量多，少量患者仅存在部分基因缺失。本发明采用微滴数字pcr方法检测sts基因外显子以及内参基因，通过多通道的荧光探针标记实现了对3到5个sts基因外显子及1个内参基因点的同时检测，兼顾了检测对象覆盖的全面性和检测结果的准确性。

16、2、独特的引物设计，避免y染色体上sts假基因的干扰。

17、3、相比现有的sts基因的拷贝数检测方法，如mlpa、基因芯片、高通量测序等，本技术方案操作简便、检测速度快、成本低，有利于x连锁鱼鳞病检测或其携带人群筛查的大规模推广。