一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基

本发明属于类器官培养，具体涉及一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基。

背景技术：

1、阴茎癌是一种在全球范围内较为罕见的恶性肿瘤，其发病率约占男性所有恶性肿瘤的1％～2％，常见于50～70岁男性，主要病理类型为阴茎鳞状细胞癌。阴茎癌的病因仍不明确，可能的危险因素有吸烟、包茎、慢性阴茎炎症、人乳头状瘤病毒(hpv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、不洁性史等。发生转移的患者5年生存率普遍较差。目前，受限于阴茎癌体外模型的不成熟，对阴茎癌的发病、转移相关机制的研究尚少，目前只能通过手术、放化疗等手段治疗，但预后仍较差，且易复发。

2、类器官(organoids)是体外三维(3d)培养形成，具有一定空间结构的组织类似物。类器官在结构与功能上可以很大程度地模拟真实器官，并能够长期稳定传代培养。类器官作为一种良好的人类疾病临床前模型，可以其特点是能更好地模拟体内环境，适用于分子和细胞生物学分析，在动物和细胞水平之间，为肿瘤研究、药物筛选等提供了一个更好的解决方案。

3、在类器官培养中，培养基的组成至关重要。类器官的生存和生长需要特定的营养物质和生长因子，而这些成分必须通过培养基来提供。培养基不仅要为类器官提供适宜的生长环境，还要维持其稳定性和保持其天然生理功能。此外，培养基中的成分和浓度也会影响类器官的分化、增殖和凋亡等过程。因此，选择和优化适合类器官培养的培养基是实现类器官培养成功的关键因素之一。目前，针对阴茎癌类器官的培养尚缺乏相关文献报道。因此，本领域亟需针对阴茎癌类器官开发培养基并建立方法，实现细胞存活率高和可多次传代的阴茎癌类器官培养。

技术实现思路

1、针对现有技术的问题，本发明提供一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基。

2、一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基，它是在advanced dmem/f12培养基作为基础培养基，加入如下配比的组分配制而成的：

3、

4、优选的，各组分的终浓度为：

5、

6、

7、本发明还提供上述培养基用于培养和/或传代阴茎癌类器官的用途。

8、本发明还提供一种阴茎癌类器官培养方法，包括如下步骤：

9、步骤1，取阴茎癌组织，消化，得到分散的细胞；

10、步骤2，将步骤1得到的细胞在加入matrigel的条件下，用上述培养基进行培养。

11、优选的，步骤1中，还对分散的细胞进行红细胞裂解；

12、和/或，步骤1中，具体包括如下步骤：

13、步骤1.1，将阴茎癌组织切成1-3mm3的小块，加入含有胶原酶ⅰ、collagenase/dispase、hbss和antibiotic-antimycotic的消化液进行震荡消化，离心；

14、步骤1.2，用trypsin-edta重悬沉淀，再次震荡消化；

15、步骤1.3，中和trypsin，停止消化，过滤，离心，即得分散的细胞；

16、和/或，步骤2中，培养条件为在37℃、体积比5％co2的环境下进行培养，每2-3天更换培养基。

17、优选的，步骤1.1中，震荡消化的条件为37℃、100-120rpm震荡消化30-60min；离心的条件为1800-2000rpm离心5～8min；

18、和/或，步骤1.2中，震荡消化的条件为37℃、100-120rpm震荡消化10～15min；

19、和/或，步骤1.3中，采用等体积的含体积比为10～20％fbs的advanced dmem/f12中和trypsin；采用70～100um滤网过滤；离心的条件为1800-2000rpm离心5～8min。

20、本发明还提供一种阴茎癌类器官传代方法，包括如下步骤：

21、步骤a，对按照上述方法培养得到的阴茎癌类器官进行消化，得到分散的细胞；

22、步骤b，将步骤a得到的细胞在加入matrigel的条件下，用权利要求1或2任一项所述培养基进行培养。

23、优选的，步骤a中，具体包括如下步骤：

24、步骤a1，吸弃孔内培养基，加预冷的cell recovery solution；

25、步骤a2，捣碎基质胶，冰上静置后，离心；

26、步骤a3，加入tryple进行消化；

27、步骤a4，反复吹打，至显微镜下观察细胞碎片大小均匀，加入相同体积预冷的权利要求1或2任一项所述培养基，离心，即得分散的细胞；

28、和/或，步骤b中，培养条件为在37℃、体积比5％co2的环境下进行培养，每2-3天更换培养基。

29、优选的，步骤a1中，cell recovery solution的加入量为每孔1ml；

30、和/或，步骤a2中，冰上静置的时间为40-60min；离心条件为4℃、300-400g离心5～8min；

31、和/或，步骤a3中，tryple加入量为每3孔1～2ml；消化条件为37℃温育15-30min；

32、和/或，步骤a4中，离心的条件为4℃、300-400g离心5～8min。

33、本发明还提供按照上述阴茎癌类器官培养方法，或上述阴茎癌类器官传代方法获得的阴茎癌类器官。

34、本发明中，体积份和重量份的比例按照如下方式确定单位：

35、1体积份:1重量份＝1ml:1g。

36、本发明所用advanced dmem/f12培养基是一种广泛使用的基础培养基，可在减少胎牛血清添加量的情况下培养哺乳动物细胞。其作为商品可以直接购买，例如：thermofisher scientific公司的商品号为12634-010的产品。

37、本发明提供了一种针对阴茎癌类器官培养和传代进行了优化的培养基，该培养基对阴茎癌类器官进行培养，具有细胞存活率高和可多次传代的优点。在优选方案中，本发明还针对阴茎癌类器官的培养和传代条件进行了优化。本发明首次实现了阴茎癌类器官的培养和稳定传代，对阴茎癌的研究和药物开发有重要意义。

38、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

39、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

技术特征：

1.一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基，其特征在于，它是以advanceddmem/f12培养基作为基础培养基，加入如下配比的组分配制而成的：

2.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于，各组分的终浓度为：

3.权利要求1或2任一项所述培养基用于培养和/或传代阴茎癌类器官的用途。

4.一种阴茎癌类器官培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.按照权利要求4所述的阴茎癌类器官培养方法，其特征在于，步骤1中，还对分散的细胞进行红细胞裂解；

6.按照权利要求5所述的阴茎癌类器官培养方法，其特征在于：步骤1.1中，震荡消化的条件为37℃、100-120rpm震荡消化30-60min；离心的条件为1800-2000rpm离心5～8min；

7.一种阴茎癌类器官传代方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.按照权利要求7所述的阴茎癌类器官传代方法，其特征在于：步骤a中，具体包括如下步骤：

9.按照权利要求8所述的阴茎癌类器官传代方法，其特征在于：步骤a1中，cellrecovery solution的加入量为每孔1ml；

10.按照权利要求4-6任一项所述的阴茎癌类器官培养方法，或权利要求7-9任一项所述的阴茎癌类器官传代方法获得的阴茎癌类器官。

技术总结
本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及一种用于阴茎癌类器官培养和/或传代的培养基。本发明的培养基由Advanced DMEM/F12培养基、GlutaMAX、HEPES缓冲液、Antibiotic‑Antimycotic、B27、N2、A8301、EGF、FGF10、Noggin、Nicotinamide、N‑acetyl‑l‑cystein、SB202190、Wnt3a、R‑spondin和Y‑27632组成。本发明还优化了阴茎癌类器官的培养方法和传代方法，实现了阴茎癌类器官的培养和稳定传代，对阴茎癌的研究和药物开发有重要意义。因此，本发明具有很好的应用前景。

技术研发人员：冯唐,邵彦翔,刘睿之,朱月婷,张春贺,刘继彦
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8