一种创制甜玉米种质的方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种创制甜玉米种质的方法及其应用。

背景技术：

1、基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，zfns)，类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，talens)和规律成簇的间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associatednuclease，crispr/cas)。crispr/cas系统大致分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型3类，其中ii型系统的组成比较简单，只需要cas9蛋白、tracrrna和crrna 3种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。ii型crispr/cas系统的特征蛋白为cas9，cas9蛋白具有ruvc和hnh两个核酸酶结构域，该结构域负责切割靶dna的两条链，从而造成靶dna双链断裂。其中hnh结构域负责切割与crrna互补的dna链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(protospacer adjacent motif，pam)上游3bp处，ruvc结构域则负责切割非互补链，切割位点位于pam上游3–8bp处。cas9蛋白同时具有加工产生crrna以及切割外源核酸的功能。crrna通过碱基配对与tracrrna结合形成tracrrna/crrna复合物，研究者可以将tracrrna和crrna作为两种向导rna(grna)或者将两者融合在一起形成单向导rna(single guide rna，sgrna)。sgrna能够与cas9核酸内切酶结合并将cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。crispr/cas9系统使目标基因dna产生双链断裂，激活细胞内的dna损伤修复机制，进而产生缺失、敲入等变异。目前，crispr/cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

2、玉米(zea maysl.)是主要的粮食作物和工业原料，对国民生产和稳定经济发展具有重要的作用，随着人民生活水平的提高，玉米已经不单单作为粮食和饲料，多用途玉米品种的培育日益受到育种家的重视。甜玉米是玉米的一个亚种，由于其可溶性糖含量较高，甜味浓郁，并携带玉米特有的香味，深受消费者喜欢。甜玉米是禾本科玉米属玉米的一个种。因为籽粒胚乳中蛋白质、脂肪和赖氨酸、色氨酸的含量比一般玉米更为丰富，并且其食用方法类似于果蔬，可直接食用，故被人们誉之为“水果玉米”。中国又是人口大国，消费群体大导致了甜玉米的需求量很大，因此甜玉米上游产业链，特别是新品种的培育等工作亟待加强。

3、甜玉米的特点是口感鲜美、甜而不腻。它的甜度主要来源于玉米粒中的糖分，这些糖分在玉米的成熟过程中被合成并储存在玉米粒中。由于甜玉米含有大量的维生素c、维生素e和β-胡萝卜素等维生素，以及钾、钙、镁等矿物质，所以甜玉米具有丰富的营养价值。此外，甜玉米还富含膳食纤维和低聚糖等营养成分，有助于促进肠道健康和降低血糖。适量食用甜玉米可以起到抗氧化、抗炎、降血压等多种保健作用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何使玉米籽粒形态具有甜玉米籽粒形态或如何创制甜玉米。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：

3、a1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；

4、a2)在制备甜玉米产品中的应用；

5、a3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；

6、a4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；

7、a5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；

8、a6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；

9、a7)在增加玉米籽粒胚大小中的应用；

10、所述蛋白质名称为sh1，可为下述任一种：

11、b1)氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

12、b2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

13、b3)在b1)或b2)的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

14、上述应用中，所述蛋白质sh1可来源于玉米(zea maysl.)。

15、为了使b1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

16、所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、gfp(绿色荧光蛋白)、cfp(青色荧光蛋白)、yfp(黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

17、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质sh1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质sh1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质sh1且具有蛋白质sh1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

18、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

19、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

20、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

21、本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：

22、d1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；

23、d2)在制备甜玉米产品中的应用；

24、d3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；

25、d4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；

26、d5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；

27、d6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；

28、d7)在增加玉米籽粒胚大小中的应用；

29、所述生物材料可为下述任一种：

30、e1)编码所述蛋白质sh1的核酸分子；

31、e2)抑制或降低所述蛋白质sh1的编码基因表达的核酸分子；

32、e3)含有e1)或e2)所述核酸分子的表达盒；

33、e4)含有e1)或e2)所述核酸分子的重组载体、或含有e3)所述表达盒的重组载体；

34、e5)含有e1)或e2)所述核酸分子的重组微生物、或含有e3)所述表达盒的重组微生物、或含有e4)所述重组载体的重组微生物；

35、e6)含有e1)或e2)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有e3)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有e4)所述重组载体的重组宿主细胞；

36、e7)含有e1)或e2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有e3)所述表达盒的转基因植物组织；

37、e8)含有e1)或e2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有e3)所述表达盒的转基因植物器官。

38、上述应用中，e1)所述核酸分子可为下述任一种：

39、f1)编码序列是seq id no.1的dna分子；

40、f2)核苷酸序列是seq id no.3的dna分子。

41、seq id no.1所示的dna分子编码氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质sh1。

42、seq id no.1所示的核苷酸序列为蛋白质sh1编码基因(cds)的核苷酸序列。

43、seq id no.3所示的核苷酸序列为zmsh1基因的基因组核苷酸序列。

44、e1)所述核酸分子还可包括在seq id no.1所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

45、e1)所述核酸分子还包括与seq id no.1或seq id no.3所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

46、本发明所述的蛋白质sh1的基因(zmsh1基因)可以为任意能够编码蛋白质sh1的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

47、上述应用中，e2)所述核酸分子可为sgrna，所述sgrna的靶序列可为seq id no.4。

48、本文所述表达盒包括启动子、编码所述蛋白质sh1的核酸分子和终止子，所述启动子可为u6启动子。

49、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

50、本文所述重组载体可为crispr/cas9敲除载体，所述crispr/cas9敲除载体可包括所述sgrna(靶序列为seq id no.4)。

51、进一步地，所述crispr/cas9敲除载体还可包括u6-2启动子(seq id no.6)。

52、进一步地，所述crispr/cas9敲除载体的核苷酸序列可为由seq id no.5和seqidno.8从n端到c端依次直接相连组成的序列。

53、本文所述重组微生物具体可为重组农杆菌eha105/crispr/cas9。

54、所述重组农杆菌eha105/crispr/cas9是将所述crispr/cas9敲除载体导入根癌农杆菌bmeha105得到的重组菌。

55、本发明还提供了sgrna，所述sgrna靶向zmsh1基因，所述sgrna的靶序列可为seqid no.4。

56、本发明还提供了含有所述sgrna的基因编辑载体，所述基因编辑载体的核苷酸序列可为由seq id no.5和seq id no.8从n端到c端依次直接相连组成的序列。

57、本发明还提供了一种培育转基因玉米的方法，所述方法包括利用基因编辑技术使目的玉米中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活，得到所述转基因玉米，所述转基因玉米具有下述任一特性：

58、g1)所述转基因玉米的籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变；

59、g2)所述转基因玉米的口感甜度高于所述目的玉米；

60、g3)所述转基因玉米的籽粒黄色强度弱于所述目的玉米；

61、g4)所述转基因玉米的籽粒胚乳皱缩程度大于所述目的玉米；

62、g5)所述转基因玉米的籽粒胚大于所述目的玉米。

63、上述方法中，所述利用基因编辑技术使目的玉米中所述蛋白质的编码基因的活性下降或失活是利用crispr/cas9系统进行，所述crispr/cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgrna的载体，所述sgrna的靶序列可为seq id no.4。

64、上述方法中，所述载体的核苷酸序列可为由seq id no.5和seq id no.8从n端到c端依次直接相连组成的序列。

65、本发明所述培育转基因玉米的方法可包括如下步骤：

66、(1)构建表达靶序列为seq id no.4的sgrna的crispr/cas9敲除载体；

67、(2)将步骤(1)构建的crispr/cas9敲除载体导入目的玉米中；

68、(3)经筛选和鉴定获得所述转基因玉米。

69、进一步地，本发明所述培育转基因玉米的方法可包括将所述crispr/cas9敲除载体(核苷酸序列由seq id no.5和seq id no.8从n端到c端依次直接相连组成)导入目的玉米，经筛选和鉴定获得所述转基因玉米。

70、所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(agrobacterium)介导的转化、生物射弹(biolistic)方法、电穿孔或in planta技术。

71、本发明还提供了突变基因或所述突变基因的下述任一种应用：

72、h1)在调控玉米籽粒胚乳淀粉含量中的应用；

73、h2)在制备甜玉米产品中的应用；

74、h3)在制备玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变的玉米中的应用；

75、h4)在增加玉米籽粒口感甜度中的应用；

76、h5)在降低玉米籽粒黄色强度中的应用；

77、h6)在增加玉米籽粒胚乳皱缩程度中的应用；

78、h7)在增加玉米籽粒胚大小中的应用；

79、所述突变基因可以是将seq id no.3所示的zmsh1基因的第1989-1990位之间插入一个核苷酸g、第1988-1993位之间删除4个核苷酸gctg或第1989-1992位之间删除2个核苷酸ct而得到。

80、本发明鉴定到的zmsh1基因及其编码蛋白可以用于改变玉米籽粒形态，进而创制甜玉米种质。通过降低zmsh1基因的表达量，如对zmsh1基因进行敲除，可以显著增加玉米籽粒的口感甜度，降低玉米籽粒黄色强度，增加玉米籽粒胚乳皱缩程度，增加玉米籽粒胚大小，使玉米籽粒形态向甜玉米籽粒形态改变。本发明首次发现了zmsh1基因及其编码蛋白在调控玉米籽粒形态中的应用，并利用zmsh1基因设计开发sgrna，基因编辑系统及其基因编辑方法，对于培育甜玉米新品种、克服传统育种的短板、促进商业化甜玉米育种进程、具有重要意义。