与豇豆豆荚可溶性糖含量QTLPSS-11.1相关的分子标记及其应用

本发明属于生物分子，涉及豇豆豆荚可溶性糖含量qtl pss-11.1相关的分子标记及其kasp引物、选育方法。

背景技术：

1、豇豆(vigna unguiculata(l.)walp.)(2n＝2x＝22)隶属豆科(fabaceae)菜豆族(trib.phasoleae dc.)豇豆属(vigna savi)，是热带和亚热带地区重要的豆类作物之一。豇豆为自花授粉二倍体，基因组大小约620mb。栽培豇豆包括普通豇豆和长豇豆两个亚种，前者以干籽粒做粮食食用，后者以嫩荚做蔬菜使用。豇豆是亚洲十大蔬菜作物之一，主要种植在中国、日本、菲律宾、泰国等地区。我国豇豆年种植面积超过800万亩，栽培面积和产量约占世界的五分之一。

2、随着产业结构调整和居民生活水平的提高，消费者对蔬菜营养品质的关注越来越高。近年来，豇豆生产上普遍存在“好吃不好看，好看不好吃”的现象，即外观商品性与内在营养品质无法协调。豇豆营养品质是一个复杂的数量性状，研究表明可溶性糖、粗蛋白、纤维素、维生素含量等均影响豇豆的口感和营养品质。品质性状受环境影响较大，且受个人品尝的主观能动性影响，因此，依靠表型鉴定严重限制了豇豆品质育种的进展。解析豇豆品质性状的遗传基础，开发育种可用的分子标记，通过分子育种辅助传统育种是促进品质育种的最佳策略。

3、随着豇豆高质量基因组的释放和测序技术的快速发展，通过重测序技术可以快速获得不同种质高质量的snp基因型数据，结合其品质数据进行全基因组范围内的关联分析，可以快速挖掘控制品质性状的遗传变异，为豇豆品质育种提供目标qtl/基因。单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，snp)由于其数量多、多态性丰富逐步成为豇豆遗传研究的主流标记，近年来，结合竞争性等位变异特异性pcr(kompetitive allelespecific pcr，kasp)技术，可以针对海量的snp标记进行灵活、个性化的筛选和应用，成为作物分子育种研究中有力的遗传工具。目前，kasp标记在水稻、玉米、菜豆等作物上已经广泛用于遗传多样性分析、基因定位和分子标记辅助选择。

4、目前豇豆性状的qtl定位研究仍属起步阶段，尤其是对品质性状豇豆豆荚中可溶性糖含量的qtl定位及分子标记的研究未见有报道。因此，开展豇豆豆荚中可溶性糖含量主效基因的qtl定位，筛选紧密连锁的分子标记比较重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供与豇豆豆荚可溶性糖含量qtl pss-11.1紧密连锁的分子标记，目的之二在于提供检测该snp位点基因型的引物对，目的之三在于提供利用该引物对进行对豆荚可溶性糖含量辅助育种的方法。该方法首先利用全基因组关联分析的方法，获得与可溶性糖含量基因紧密连锁的snp，再将snp转化为kasp标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本可溶性糖含量的有利等位变异，从而为豇豆豆荚可溶性糖含量性状的遗传改良提供新的技术支撑。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、本发明首先构建了一个含344份种质的豇豆核心种质群体，随后于2021年在杭州和广州两地分别进行种植，取各材料商品成熟期(开花后15天)的豆荚，测量可溶性糖含量，采用蒽酮比色法进行测定，使用产自苏州科铭生物技术有限公司的植物可溶性糖含量试剂盒。利用重测序技术对344份种质进行基因型鉴定，鉴定出1,262,497个高质量snp用于群体结构分析和关联分析，结合该群体的嫩荚可溶性糖含量表型，利用gemma软件在全基因组范围内鉴定出3个与嫩荚可溶性糖含量显著相关的区段，其中pss-11.1区段含有一个β-半乳糖苷酶基因vupss3，可能与可溶性糖的合成与转运相关，本发明根据vupss3的基因组序列，设计出一个位于11号染色体41950713bp处的snp-kasp标记vupss3_41950713与可溶性糖含量显著相关，说明该标记可以指示豆荚可溶性糖含量基因vupss3的筛选，利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型即可判断样本是否携带控制豆荚可溶性糖含量的有利等位变异，基因型的多态性为c/t。进一步用220份其它豇豆种质得到验证。

4、具体的vupss3基因在41950713bp处的snp为c/t，其在群体中序列变异为：

5、tcacaaagttttatggccttatgcaagtctttaaggtggccccacttagg[c/t]tgtctaatagttcctgcatcatgcagttcagatatatttagaagaatata seq id no：1。

6、2、检测豇豆豆荚可溶性糖含量qtl pss-11.1紧密连锁的分子标记的kasp引物，所述kasp引物为以下具体序列：

7、vupss3_41950713kasp引物：

8、vupss3_41950713primer1：

9、5’-gaaggtgaccaagttcatgcttctttaaggtggccccacttaggc-3’；

10、vupss3_41950713primer2：

11、5’-gaaggtcggagtcaacggatttctttaaggtggccccacttaggt-3’；

12、vupss3_41950713primer1和vupss3_41950713primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；

13、vupss3_41950713primer_common：

14、5’-tatatctgaactgcatgatgca-3’。

15、其中vupss3_41950713primer1连接fam基团，vupss3_41950713primer2连接hex基团。

16、3、以上技术方案中所述kasp引物、含有kasp引物的试剂或试剂盒在检测豇豆豆荚可溶性糖含量基因中的应用。

17、4、利用豇豆嫩荚可溶性糖含量基因紧密连锁的分子标记的kasp引物进行选育不同豆荚可溶性糖含量高低豇豆品种的方法，所述方法具体包括以下步骤：

18、s1、提取豇豆植株样本基因组dna；

19、s2、以豇豆植株样本基因组dna为模板，利用vupss3_41950713kasp引物进行kasp标记鉴定；

20、所述vupss3_41950713kasp引物为：

21、vupss3_41950713primer1：

22、5’-gaaggtgaccaagttcatgcttctttaaggtggccccacttaggc-3’；

23、vupss3_41950713primer2：

24、5’-gaaggtcggagtcaacggatttctttaaggtggccccacttaggt-3’；

25、vupss3_41950713primer1和vupss3_41950713primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光基团；

26、vupss3_41950713primer_common：5’-tatatctgaactgcatgatgca-3’。

27、s3、读取kasp反应检测的荧光信号，若豇豆植株样本基因组dna显示vupss3_41950713primer2所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带高可溶性糖含量性状基因型；若豇豆植株样本基因组dna显示vupss3_41950713primer1所带荧光基团信号，则即可判断该样本携带低可溶性糖含量性状基因型。

28、进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，其中primer1连接fam基团，primer2连接hex基团。

29、进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，kasp反应检测还包括2xkasp master mix试剂。

30、进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，kasp反应检测的pcr体系为：dna 0.8μl，2x kasp master mix 0.75μl，primer mix 0.05μl。

31、进一步，选育不同豆荚可溶性糖含量豇豆品种的方法中，kasp反应检测的pcr反应程序为94℃预变性15分钟，94℃变性20秒，61～55℃梯度复性60秒，每个循环复性温度降低0.6℃，55℃延伸60秒，循环10次；再94℃变性20秒，55℃复性60秒，延伸60秒，循环26次。

32、本发明的有益效果在于：本发明从344份豇豆核心种质群体的种质的基因型鉴定中，结合该群体的嫩荚可溶性糖含量表型，得出的vupss3基因上snp表型值能够准确区分品种的可溶性糖含量高低。在豇豆品种g98基因组上11号染色体41950713bp处具有c/t多态性，进一步开发了相关的kasp标记进行验证，并利用该标记扩增需要鉴定的材料，验证得到其基因型c/t判断样本中的有利等位变异，可准确快速判断豆荚品种可溶性糖含量高低。从而为豇豆豆荚可溶性糖含量性状的遗传改良提供快速、可靠的检测手段。

33、利用本发明提供的分子标记及其引物进行不同可溶性糖含量性状的辅助筛选，不进行dna测序、限制性内切酶等的使用，操作方法简单、快速，而且可以在短时间内进行高通量样本检测，节省人力物力，为豇豆遗传多样性分析、基因定位及未来的分子育种提供充足的标记资源。相比较于传统的基于表型选择，本发明所带来的选择结果更准确，重复性好，极大地提高了品种选育效率，简化育种程序，缩短育种年限。