一种GSK-3α抑制剂的制备方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种gsk-3α抑制剂的制备方法。

背景技术：

1、糖原合成酶激酶-3α（gsk-3α）是一种在哺乳动物体内广泛存在的具有严格进化保守性的激酶，分子量为51 kda。

2、gsk-3α是蛋白激酶b （pkb）的主要生理底物，其活性受到pkb/akt介导的磷酸化的抑制，以响应某些生长因子刺激，如神经生长因子（ngf）和神经胶质细胞系衍生的神经营养因子。

3、gsk-3α在许多不同的细胞过程中发挥重要作用，包括骨骼肌中的糖原合成、神经元细胞存活和通过增加糖原合成和凋亡来缓解高血糖症。gsk-3α的表达和活性与各种疾病过程相关，gsk-3α抑制剂已成为治疗糖尿病、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）、神经障碍（如双相情感障碍、中风、炎症和癌症）的有前途的药物。

4、sb-216763是一种新型的高效gsk-3α选择性抑制剂，其ic50值为34 nm，该分子是一种结构独特的马来酰亚胺，同位素标记的sb-216763还可作为生物医学成像技术正电子发射断层扫描（pet）的新探针，并能够对疾病中的酶gsk-3α进行无创监测，在医学研究领域具有极高的应用价值。但由于目前制备方法的限制，sb-216763的价格普遍较高。

5、目前主要通过化学合成制备sb-216763，其反应路线如下：

6、

7、但是上述反应路线存在以下不足之处：1.反应中间体稳定性差，导致整体产率不高（通常低于30%）；2.反应原料和反应副产物容易造成化学污染，化学残留影响sb-216763在后续生物科研领域应用过程中的结果准确性。

技术实现思路

1、发明目的：针对传统的sb-216763的化学合成方法中存在的合成产率不高、存在化学污染和残留等问题，本发明公开了一种gsk-3α抑制剂的制备方法。

2、本发明改造了一种放线菌 lentzea albida的血红素依赖性氧化酶得到了关键合成酶la1263，并利用pmlaad蛋白和marc蛋白与关键合成酶la1263合作制备sb-216763。

3、技术方案：一种gsk-3α抑制剂的制备方法，步骤如下：

4、步骤一、关键合成酶的合成和表达载体的构建

5、（11）对放线菌 lentzea albida的血红素依赖性氧化酶进行结构改造得到关键合成酶la1263，所述关键合成酶la1263的氨基酸序列如seq id no.1所示；

6、（12）利用gibson拼接克隆技术，将关键合成酶la1263的基因片段克隆到载体pmcsg10中得到表达载体pmcsg10-la1263，将基因片段pmlaad克隆到载体pet28a(+)中得到表达载体pet28a(+)-pmlaad，将基因片段marc克隆到载体pet26b中得到表达载体pet26b-marc，其中：

7、基因片段pmlaad的氨基酸序列如seq id no.2所示；

8、基因片段marc的氨基酸序列如seq id no.3所示；

9、（13）将构建好的表达载体pet28a(+)-pmlaad、表达载体pmcsg10-la1263、表达载体pet26b-marc分别转化到感受态细胞bl21(de3)中得到菌种溶液，分别于-80℃保存；

10、步骤二、关键合成酶的表达

11、（21）制备pmlaad蛋白粗制裂解液；

12、（22）制备la1263蛋白粗制裂解液；

13、（23）制备marc蛋白粗制裂解液；

14、步骤三、酶促反应体系的搭建

15、（31）向反应容器中依次加入下列物质:

16、

17、（32）混匀后，震荡反应6-8h，震荡反应全程保持反应容器为敞口状态；

18、（33）分别向反应容器中加入600ml marc蛋白粗制裂解液、2.1g α-酮戊二酸、1.32g抗坏血酸、适量的硫酸亚铁，使得硫酸亚铁在菌液中的浓度为0.1mm，混匀后，继续震荡反应2h得到反应液；

19、步骤四、产物的分离

20、将步骤三得到的反应液进行后处理，完成后即得到gsk-3α抑制剂。

21、进一步地，步骤（21）的具体步骤如下：

22、（211）取10μl的pet28a(+)-pmlaad菌种溶液，加入到5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pet28a(+)-pmlaad种子液，其中：

23、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；

24、（212）将步骤（211）的得到的pet28a(+)-pmlaad种子液全部加入到含1l的lb液体培养基的试验容器中，然后在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至菌液中含pmlaad表达载体的菌液浓度od600=1.1-1.3为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：

25、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；

26、（213）向经过步骤（212）处理的菌液中加入适量的iptg，使得iptg在菌液中的浓度为0.1mm，混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；

27、（214）将经过步骤（213）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddh2o清洗，随后加入30ml上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：

28、所述上样缓冲液的ph值为8.0；

29、所述上样缓冲液包括：100mm tris-hcl、300mm nacl、5mm咪唑、10%v/v甘油，余量为水；

30、（215）利用超生破碎仪将步骤（214）得到的菌体重悬液破碎得到破碎后的菌液，其中：

31、变幅杆直径为6mm；

32、破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；

33、（216）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到pmlaad蛋白粗制裂解液。

34、进一步地，步骤（22）的具体步骤如下：

35、（221）取10μl的pmcsg10-la1263菌种溶液，加入到5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pet26b-la1263种子液，其中：

36、lb液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/ml；

37、（222）将步骤（221）得到的pmcsg10-la1263种子液加入到含1l的lb液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养，至含la1263表达载体的菌液浓度od600=0.7-0.9为止，随后将试验容器并置于冰浴中30min，其中：

38、lb液体培养基中含氨苄青霉素，其浓度为50μg/ml；

39、（223）向经过步骤（222）处理的菌液中分别加入适量的硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、iptg，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μm，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mm，iptg在菌液中的浓度为0.1mm，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；

40、（224）将经过步骤（223）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddh2o清洗，随后加入30ml上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：

41、所述上样缓冲液的ph值为8.0；

42、所述上样缓冲液包括：100mm tris-hcl、300mm nacl、15mm咪唑、10%v/v甘油，余量为水；

43、（225）利用超生破碎仪将步骤（224）得到的菌体重悬液破碎，其中：

44、变幅杆直径为6mm；

45、破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；

46、（226）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液，即得到la1263蛋白粗制裂解液。

47、进一步地，步骤（23）的具体步骤如下：

48、（231）取10μl的pet26b-marc菌种溶液，加入到5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm震荡过夜培养，得到pet26b-marc种子液，其中：

49、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；

50、（232）将步骤（231）得到的pet26b-marc种子液加入到含1l的lb液体培养基的试验容器中，在摇床内以37℃、200rpm震荡培养至含marc表达载体的菌液浓度od600=0.9-1.1为止，随后将试验容器取出并置于冰浴中30min，其中：

51、lb液体培养基中含卡那霉素，其浓度为50μg/ml；

52、（233）向经过步骤（232）处理的菌液中分别加入硫酸亚铁铵、5-氨基乙酰丙酸、iptg，使得硫酸亚铁铵在菌液中的浓度为40μm，5-氨基乙酰丙酸在菌液中的浓度为0.25mm，iptg在菌液中的浓度为0.1mm，然后混匀后放入摇床内以18℃、200rpm诱导培养16h；

53、（234）将经过步骤（233）诱导完毕的菌液倒入离心杯，4000g离心15min，弃上清液，沉淀表面用ddh2o清洗，随后加入30ml上样缓冲液将沉淀菌体重悬至无明显菌块得到菌体重悬液，其中：

54、所述上样缓冲液的ph值为8.0；

55、所述上样缓冲液包括：100mm tris-hcl、300mm nacl、15mm咪唑、10%v/v甘油，余量为水；

56、（235）利用超生破碎仪将菌体重悬液破碎，其中：

57、变幅杆直径为6mm；

58、破碎程序为：能量40%，超声循环工作时间2s、暂停时间4s，工作总时间30min；

59、（236）将破碎后的菌液以10000g低温离心15min，取上清液即得到marc蛋白粗制裂解液。

60、进一步地，步骤（31）中所述nah2po4-na2hpo4缓冲液的浓度为1m，ph值为8.0；

61、步骤（31）中所述(nh4)2so4储备液的浓度为2m。

62、进一步地，步骤四中的后处理的具体步骤如下：

63、将步骤三得到的反应液用1n稀盐酸调节至ph=1，然后向其中加入1l乙酸乙酯萃取至少三次，乳化层使用硅藻土过滤后分液，合并有机相并使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产物，然后将粗产物使用硅胶柱色谱进行纯化，dcm/meoh= 20:1条件下洗脱得到橙红色产物即得到gsk-3α抑制剂。

64、有益效果：本发明具有以下有益效果：

65、1、以廉价且生物亲和性良好的l-色氨酸和2,3-二氯-l-苯丙氨酸为底物，规避了现有方法中毒性化学品作为底物的参与，提高原子利用率、减小化学污染和可能引入的毒副作用；

66、2、提升了gsk-3α抑制剂sb-216763的产率。