本发明涉及卷柏中提取穗花杉双黄酮和海藻糖的工艺。
背景技术：
1、海藻糖是一种非还原性二糖，又称漏芦糖、蕈糖，具有稳定生物大分子的作用，能使处于恶劣环境的生物体的分子结构免遭破坏，维持生命体的生物特征。海藻糖自1832年被科学家发现后，就以其独特的生物学功能和作用机理吸引很多学者对其展开研究和探索。
2、截至目前，海藻糖的制备方法主要有以下几种：
3、(1)微生物抽提法:这是传统的海藻糖生产方法，以乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌体为提取源。
4、(2)发酵法:这种方法是用一定的基质在一定条件下(ph、温度、渗透压等)培养微生物，通过生物发酵产生海藻糖再由培养液提取精制而成。该方法的缺点是微生物对发酵条件要求苛刻，且转化率低,发酵液成分复杂,海藻糖的提取、精制困难。
5、(3)化学合成法:海藻糖的化学合成法主要是在2,3,4,6-四乙酞基葡萄糖和3,4,6-三乙酞-l,2-脱水-d-葡萄糖之间产生环氧乙烷加成反应。化学合成法使用了大量的有机溶剂，且合成路线复杂、产率低、合成难度大、分离困难等问题，所以目前还处于研究阶段，还没有实现工业化生产。
6、(4)酶转化法:可采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或淀粉为底物，通过有关酶的作用转换成海藻糖。该方法为现有技术中应用最为广泛地海藻糖制备方法，例如专利cn202210362640.1提供了基于固定化海藻糖合成酶技术的海藻糖生产方法。虽然酶转化法具有较高的特异性和快速温和等特点，但是酶具有不稳定，重复性低，因此也存在转化率低等风险。
7、(5)基因工程法:用生物技术生产海藻糖或将葡萄糖转化为海藻糖的基因通过一种细菌导入甜菜、马铃薯、番茄等植物中构建具有生产海藻糖能力的转基因植物。
8、综上所述，长期以来，工业上制备海藻糖的来源主要是乳酸菌、酵母、霉菌及其它一些含海藻糖的菌体、酶合成、转基因植物，天然植物来源生产制备海藻糖并未见到任何报道。
9、卷柏为蕨类植物门卷柏科卷柏属植物，全世界约有700种，我国多数省份均产。最早收载于《神农本草经》，《中华人民共和国药典》收录卷柏来源为蕨类植物卷柏科卷柏[selaginella tamariscina(beauv.)spring]或垫状卷柏[selaginella pulvinata(hook.et grev.)maxim.]的干燥全草。
10、卷柏富含黄酮类化合物、甾醇、生物碱类、酚类、海藻糖等。目前对卷柏提取物开发应用的重点主要集中在黄酮类化合物和酚类化合物，例如穗花杉双黄酮、苯丙素、炔酚等。但是现有技术中，对于包含糖苷类和黄酮类组合物的植物进行提取精制时，通常仅提取含量高或者附加值高的某一特定产物，例如现有技术中对于卷柏的加工主要是提取穗花杉双黄酮，没有涉及工业上可实现的在提取过程中将糖类和黄酮类进行分离，并分别精制的技术手段。
技术实现思路
1、本发明的目的是开发一条工业化可实现的，从卷柏提取穗花杉双黄酮废弃物中提取高纯度海藻糖的工艺，提高卷柏的综合利用度和深入开发卷柏的应用。
2、为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
3、一种卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，包括以下步骤：
4、步骤s1：卷柏经粉碎处理后，加入溶媒，提取，收集提取液，浓缩得卷柏粗提物；提取方式可以为回流提取，另外还可以采用冷浸提取、超声提取或渗滤法提取等方式；优选的，溶媒为水、低级醇、乙腈或者丙酮中的一种或者两种以上溶剂组成。所述低级醇指的是乙醇、甲醇等。
5、步骤s2：向卷柏粗提物中加入纯化水溶解，过滤，收集卷柏粗提物滤液和卷柏粗提物滤渣；
6、步骤s3：将s2中的卷柏粗提物滤渣，经乙醇溶解后过滤，滤液上样大孔吸附树脂柱分离纯化，得到穗花杉双黄酮；
7、将s2中的卷柏粗提物滤液浓缩干燥得海藻糖浸膏；
8、步骤s4：向s3所得的海藻糖浸膏中加入体积分数为60～95％的乙醇水溶液并在60～80℃条件使其溶解，过滤，滤液保温10～60min后，在0～40℃条件下结晶12h，过滤，收集海藻糖粗晶体；
9、步骤s5：将s4所得的海藻糖粗晶体在60～80℃下，加入体积分数为60～95％的乙醇水溶液并在60～80℃条件使其溶解，过滤，滤液保温10～60min后，在0～40℃条件下结晶12h，过滤，收集海藻糖高纯度晶体；
10、所述海藻糖粗晶体与乙醇水溶液的质量体积比为1:8～20g/ml。
11、具体地，所述卷柏为卷柏s.tamariscina、垫状卷柏s.pulvinata、中华卷柏s.sinensis、江南卷柏s.moellendorffii中的一种。
12、优选地，所述卷柏为卷柏s.tamariscina、垫状卷柏s.pulvinata。
13、发明人探究发现，采用同样的提取工艺，卷柏s.tamariscina、垫状卷柏s.pulvinata提取的海藻糖纯度较高，可以达到90％以上。
14、进一步地，所述卷柏为卷柏s.tamariscina，制备的海藻糖纯度可以达到99％以上。
15、优选的，s1中溶媒体积与药材质量的比例为ml:g＝(40～2)：1，优选(15～2)：1。溶媒是体积浓度为80～100％的乙醇水溶液，优选体积浓度为85％～100％乙醇水溶液。更进一步地，所述溶媒是体积浓度为95％乙醇水溶液。
16、具体地，步骤s4中，乙醇水溶液的体积分数为60～95％。海藻糖浸膏与乙醇水溶液的质量体积比为1:8～20g/ml；优选的，所述海藻糖浸膏加热到60～80℃加入乙醇水溶液。优选的，s4中在4℃条件下结晶。
17、本发明所达到的有益效果是：
18、1、本发明以卷柏为原料，联合提取穗花杉双黄酮和高纯度海藻糖，不仅提高穗花杉双黄酮最终产物的纯度，而且避免卷柏中有价值的海藻糖的浪费，海藻糖的得率在0.2-2.0％之间，产品纯度大于95.0％，提高卷柏的生物利用度。
19、2、本发明的制备方法仅仅通过溶剂提取，使用的溶剂操作安全、易于从产品中除去且避免溶剂残留，经溶剂提取、水洗提纯、结晶就能制备含量大于95.0％的纯品。无需活性碳处理，无需树脂纯化，制备工艺环保、不产生固废物、易于放大、工艺简单。
20、3、本发明所述的原料为卷柏s.tamariscina、旱生卷柏s.stauntoniana、中华卷柏s.sinensis、江南卷柏s.moellendorffii、垫状卷柏s.pulvinata、与深绿卷柏s.doederleinii等卷柏属植物，原料来源广泛，为制备海藻糖相关药物提供了一条廉价易得的来源途径，对卷柏的综合利用和深入开发具有显著的意义。
1.一种卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，s1中提取方式为回流提取、冷浸提取、超声提取或渗滤法提取中的任意一种。
3.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，s1中溶媒为水、乙醇、甲醇、乙腈或丙酮中的任意一种或者两种以上。
4.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，所述的卷柏为卷柏s.tamariscina、垫状卷柏s.pulvinata、中华卷柏s.sinensis或江南卷柏s.moellendorffii中的任意一种或多种。
5.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，s1中，溶媒是体积浓度为80～100％的乙醇水溶液，溶媒体积与药材质量的比例为ml:g＝(40～2)：1。
6.如权利要求5所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，s1中，溶媒是体积浓度为85％～100％的乙醇水溶液，溶媒体积与药材质量的比例为ml:g＝15～2：1。
7.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，
8.如权利要求1或7所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，s4中所述海藻糖浸膏加热到60～80℃加入乙醇水溶液。
9.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，s5中所述海藻糖粗晶体与乙醇水溶液的质量体积比为1:8～20g/ml。
10.如权利要求1所述的卷柏中进行穗花杉双黄酮和海藻糖联合提取的方法，其特征在于，