一种球孢白僵菌网片载体、其制备方法及其在地下害虫防治中的应用与流程

本发明涉及植物虫害防治领域，尤其涉及一种球孢白僵菌网片载体、其制备方法及其在地下害虫防治中的应用。

背景技术：

1、地下害虫是指主要为害虫态在土壤内，以作物的根、茎和种子等地表以下部分或者临近地表部分为食的一类害虫，其具有种类多、数量大、分布广以及食性杂等特点，严重危害农业发展，造成巨大损失。目前，在我国发生最为严重的地下害虫主要有蒙古拟地甲gonocephalum mongolicum、小地老虎agrotis ipsilon和蝼蛄gryllotalpa等，主要通过啃食作物幼苗的地下根系或茎基部，造成植株倒伏、死亡和缺苗断垄。目前地下害虫的防治措施仍以化学药剂为主，如使用辛硫磷、吡虫啉和氯虫苯甲酰胺等化学杀虫剂进行防治。但是化学农药的过度使用，不仅会对环境造成一定的污染，还会使地下害虫的抗性增加，加大地下害虫的防治难度。生物防治能够在一定程度上避免对环境的不良影响，虫生真菌作为一种接触性生物杀虫剂，已经被广泛开发和利用。

2、白僵菌属beauveria是一类常见的昆虫病原真菌，其寄主范围广，能够寄生15个目的700余种昆虫，同时具有致病力强，对人畜安全和环境无污染等优点，在害虫生物防治中发挥着重要作用。其中，球孢白僵菌b.bassiana是目前本领域研究以及应用最多的虫生真菌，在自然条件下能够对多种地下害虫具有较好的致病力。

3、因此，制备数量大、质量优的球孢白僵菌孢子粉变得至关重要，目前对于白僵菌分生孢子的规模化生产方式主要通过液固双相发酵法。而传统固体发酵底面透水透气性差，球孢白僵菌只能在发酵物表面进行产孢，严重限制了球孢白僵菌产孢量的最大化。

4、具体而言，目前，本领域对白僵菌菌株固态培养原料的研究一般采用易得、价廉的陈米、麦麸、稻壳等农副产品，由于培养基组分不确定，发酵后的产量也不稳定。比如狄雪塬等通过对球孢白僵菌ys03菌株的产孢培养基的配方进行改良，结果表明，当花生为59.9g，麦麸为76.08g，玉米粉为88.33g，培养基产孢量为6.15×107个/ml。

技术实现思路

1、本发明的目的之一，就在于提供一种球孢白僵菌网片载体的制备方法，以解决上述问题。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种球孢白僵菌网片载体的制备方法，包括下述步骤：

3、(1)取原料，所述原料包括：大米粉、豆粕、秸秆粉和酵母粉；还包括黏附剂；

4、(2)将步骤(1)的原料与蒸馏水混合，使原料浓度为大米粉40-80g/l，豆粕15-25g/l，秸秆粉40-60g/l，酵母粉10-20g/l，黏附剂15-25g/l；然后灭菌制成平板，最后对平板进行开孔，即得网片载体。

5、制备得到的网片载体，后续在载体上接种球孢白僵菌比如bb324，待发酵完成后进行收取孢子粉，再将网片载体放入田中阻隔地下害虫，并且由于网片载体上仍存在一定量的孢子，载体施入田后仍能通过孢子侵染地下害虫。

6、本发明的主要创新点是采用了新的网片载体的配方(大米粉、豆粕、秸秆粉、酵母粉及特定比例)以及特殊的开孔，从而显著提高了球孢白僵菌比如bb324的产孢量，并且由于网片载体是使用廉价农副产品进行制作，不仅成本低，而且由于进行开孔，网片载体的孢子是可以在正面、背面、侧面以及孔洞内部进行繁殖，这是目前未有的研究成果，提高了经济收益，在网片载体收孢后，表面仍残留一定数量的孢子，对害虫具有一定的侵染效果，而且秸秆等成分能够被环境分解，作为养分促进植物生长。

7、作为优选的技术方案，大米粉59g/l，豆粕21g/l，秸秆粉49g/l，酵母粉14g/l，黏附剂20g/l。这样的浓度和配比，所制得的网片载体用于球孢白僵菌培养时产孢量较大。

8、作为优选的技术方案，其特征在于，大米粉59.32g/l，豆粕21.06g/l，秸秆粉49.01g/l，酵母粉14.38g/l，黏附剂20g/l。这样的浓度和配比，所制得的网片载体用于球孢白僵菌培养时产孢量最大。

9、作为优选的技术方案，所述黏附剂为琼脂。

10、需要说明的是，本申请的黏附剂的作用是用于网片载体的成型，黏附剂不会影响白僵菌的产孢量。

11、本发明的目的之二，在于提供一种采用方法制备得到的球孢白僵菌网片载体。

12、本发明的目的之三，在于提供一种采用上述方法制备得到的球孢白僵菌网片载体的应用，技术方案为，将所述球孢白僵菌网片载体用于培养球孢白僵菌。

13、作为优选的技术方案，所述培养方法包括下述步骤：

14、(1)配制sday液体培养基：取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和纯水混匀后灭菌；(2)培养基冷却后，将灭菌的接种环刮取球孢白僵菌菌株置于液体培养基中，接菌，摇匀，置于摇床中培养，得到种子培养液；(3)网片载体灭菌制成平板后，将步骤(2)所得的种子培养液稀释，每一面均匀涂布在网片载体上，置于培养箱中进行培养，即得。

15、进一步优选的，所述培养方法为：(1)配制sday液体培养基：4.0g葡萄糖、1.0g蛋白胨、1.0g酵母粉和100ml纯水混匀后在高压蒸汽灭菌锅内115℃灭菌15min；(2)培养基冷却后，将灭菌的接种环轻轻刮取菌株bb324置于液体培养基中，接菌6次，摇匀，置于27±1℃，180r/min的摇床中，培养4d，得到种子培养液；(3)网片载体灭菌制成平板后，将种子培养液稀释至1.0×107孢子/ml，每一面吸取1000μl均匀涂布在网片载体上，置于26±2℃、rh＞80％和l：d＝12h：12h培养箱中进行培养。

16、作为进一步优选的技术方案，所述网片载体孔洞形状选自圆形、梅花形、半圆形、三角形、内三角形、四叶草形、五角星形、榄方形中的至少一种。

17、作为更进一步优选的技术方案，所述网片载体孔洞形状为圆形。采用圆形的孔洞时，表面产孢量、孔洞产孢量和侧面产孢量均较大。

18、作为更进一步优选的技术方案，所述网片载体孔洞形状为五角星形。采用五角星形时，对对、小地老虎3龄幼虫、东方蝼蛄成虫和蒙古拟地甲成虫24h的阻隔率均较高。

19、作为进一步优选的技术方案，所述球孢白僵菌网片载体培养球孢白僵菌后，用于地下害虫的防治和/或促进植物生长。

20、作为更进一步优选的技术方案，所述地下害虫为小地老虎、东方蝼蛄或蒙古拟地甲中的至少一种。

21、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明以大米粉、豆粕和小麦秸秆粉等廉价副产品为原料，制备得到能够防虫、促进植物生长且能够大量产孢的白僵菌网片载体，能够增加表面产孢量，不仅成本低，而且能够有效阻隔三种地下害虫；并且施用网片载体后，能够显著促进植物比如玉米的生长，能够作为新型防治措施进行商业化生产和推广。

技术特征：

1.一种球孢白僵菌网片载体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌网片载体的制备方法，其特征在于，大米粉59 g/l，豆粕21 g/l，秸秆粉49 g/l，酵母粉14 g/l，黏附剂20 g/l。

3.根据权利要求1所述的球孢白僵菌网片载体的制备方法，其特征在于，大米粉59.32g/l，豆粕21.06 g/l，秸秆粉49.01 g/l，酵母粉14.38 g/l，黏附剂20 g/l。

4.权利要求1-3任一项的方法制备得到的球孢白僵菌网片载体。

5.权利要求1-3任一项的方法制备得到的球孢白僵菌网片载体的应用，其特征在于，将所述球孢白僵菌网片载体用于培养球孢白僵菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述培养方法包括下述步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述网片载体孔洞形状选自圆形、梅花形、半圆形、三角形、内三角形、四叶草形、五角星形、榄方形中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述网片载体孔洞形状为圆形或五角星形。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述球孢白僵菌网片载体培养球孢白僵菌后，用于地下害虫的防治和/或促进植物生长。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述地下害虫为小地老虎、东方蝼蛄或蒙古拟地甲中的至少一种。

技术总结
本发明公开了一种球孢白僵菌网片载体、其制备方法及其在地下害虫防治中的应用，属于植物虫害防治领域，本发明以大米粉、豆粕和小麦秸秆粉等廉价副产品为原料，制备得到能够防虫、促进植物生长且能够大量产孢的白僵菌网片载体，能够增加表面产孢量，不仅成本低，而且能够有效阻隔三种地下害虫；并且施用网片载体后，能够显著促进植物比如玉米的生长，能够作为新型防治措施进行商业化生产和推广。

技术研发人员：雷晓,李茂业,周本国,李武业,刘苏,夏春,王李芳,靳凯丽,张永辉,李世广,赵锦超,洪牛,沈望熙,谢强,张今,王飞,肖清华,张明金,姬鸿飞,高庆勇
受保护的技术使用者：四川省烟草公司泸州市公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17