一种用于精准编辑牛Oct4的sgRNA及其应用

本发明涉及基因工程和细胞工程，尤其涉及一种用于精准编辑牛oct4的sgrna及其应用。

背景技术：

1、目多能干细胞是一类具有无限增殖、自我更新和分化成所有主要细胞系潜能的干细胞，根据来源可分为胚胎干细胞和诱导多能干细胞。利用牛多能干细胞可以开展牛早期胚胎发生、组织分化、药物筛选、疾病模型建立、移植治疗、牛品种改良及转基因工程等科学研究，因此，牛多能干细胞在农业、生物及医学等领域具有巨大的应用潜力。

2、研究较早的动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，由剑桥大学m.j.evans、m.h.kaufman和加利福尼亚大学gail.r.martin于1981年分别在nature和pnas上刊发其研究成果。随后，猕猴、人、大鼠的胚胎干细胞相继分离建系成功。然而，家畜胚胎干细胞的研究相对较为滞后，2018年，bogliotti ys从牛囊胚中分离建系牛的胚胎干细胞，成功建立了类似于episc的牛胚胎干细胞培养体系。此外，lixia zhao利用yamanaka四因子也成功建立了牛诱导多能干细胞。利用牛多能干细胞可以开展定向诱导分化，结合基因编辑可以构建精准育种体系，结合全基因组选择可构建体外育种模型，因此，牛多能干细胞具有巨大的商业开发价值。

3、oct-4(也叫oct-3或oct3/4)属pou转录因子一员，最初鉴定为dna结合蛋白，可通过顺式元件活化基因转录，是胚胎干细胞维持多能性和自我更新的关键蛋白，也是将体细胞重编程为诱导多能干细胞的必要因子，因此，oct4被作为鉴定es细胞多能性的首要标志物。在多能干细胞定向诱导分化研究中，为了方便监测干细胞多能性的变化，研究人员已在人多能干细胞和小鼠多能干细胞中通过对内源性oct4定点敲入gfp，指示oct4的表达，根据oct4的表达变化来优化培养体系。仍然，目前尚无指示内源性oct4表达的牛多能干细胞系，因此，无法在利用牛干细胞开展定向诱导分化和发育潜能优化时实时监测牛干细胞多能性的变化。

技术实现思路

1、为解决无指示内源性oct4表达的牛多能干细胞系的技术问题，本发明提供一种用于精准编辑牛oct4的sgrna及其应用。

2、本发明采用以下技术方案实现：一种用于精准编辑牛oct4的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no：1所示。

3、一种用于扩增sgrna的引物，所述引物包括840位点引物、oct4t体外切割模板扩增引物和b840-px330体外转录模板扩增引物；

4、其中，840位点引物包括核苷酸序列如seq id no：2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：3所示的反向引物；

5、oct4体外切割模板扩增引物包括核苷酸序列如seq id no：4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：5所示的反向引物；

6、b840-px330体外转录模板扩增引物的核苷酸序列如seq id no：6所示。

7、一种包含所述sgrna的重组载体。

8、作为上述方案的进一步改进，所述重组载体为在px330载体上插入所述sgrna得到。

9、一种包含所述sgrna的donor质粒。

10、作为上述方案的进一步改进，所述donor质粒的结构为sgrna+lha+p2a+egfp+t2a+puro+rha+sgrna，其中sgrna的核苷酸序列如seq idno：1所示，lha的核苷酸序列如seq idno：7所示，p2a的核苷酸序列如seq id no：8所示，egfp的核苷酸序列如seq id no：9所示，t2a的核苷酸序列如seq id no：10所示，puro的核苷酸序列如seq id no：11所示，rha的核苷酸序列如seq id no：12所示。

11、一种用于精准编辑牛oct4的产物，所述产物包括sgrna、sgrna的引物、重组载体、donor质粒其中至少一种。

12、作为上述方案的进一步改进，所述产物包括：试剂、试剂盒、芯片。

13、作为上述方案的进一步改进，精准编辑牛oct4的方法，包括以下步骤：

14、s1、基于oct4基因序列，设计并合成靶向第四外显子位点的sgrna，其中sgrna的核苷酸序列如seq id no：1所示；

15、s2、利用840位点引物对sgrna进行退火处理，得到sgrna退火产物；

16、s3、对载体px330进行酶切，利用bbs1酶对质粒载体进行酶切操作，得到px330酶切后产物；

17、s4、将sgrna退火产物插入到px330酶切后产物中，得到重组载体；

18、s5、利用oct4体外切割模板扩增引物扩增含sgrna位点的体外切割模板；

19、s6、使用b840-px330作为扩增模板，t7启动子的dna序列为特上游引物，sgrna骨架dna序列作为下游引物进行pcr扩增。

20、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

21、本发明用于精准编辑牛oct4基因的sgrna，针对牛oct4基因第四外显子区域设计sgrna，针对切割位点设计可实现高效同源重组的上、下游特异性同源臂；利用crispr-cas9技术，靶向内源性oct4特定位点进行精确切割，利用同源重组插入gfp，成功构建oct4表达示踪报告系统，达到有效监测多能干细胞内源性oct4表达的目的，可在后续开展定向诱导研究时，实时掌握细胞多能性的动态变化。

技术特征：

1.一种用于精准编辑牛oct4的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq idno：1所示。

2.一种用于扩增sgrna的引物，其特征在于，所述引物包括840位点引物、oct4体外切割模板扩增引物和b840-px330体外转录扩增引物；

3.一种包含权利要求1所述sgrna的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为在px330载体上插入所述sgrna得到。

5.一种包含权利要求1所述sgrna的donor质粒。

6.如权利要求5所述的donor质粒，其特征在于，所述donor质粒的结构为sgrna+lha+p2a+egfp+t2a+puro+rha+sgrna，其中sgrna的核苷酸序列如seq id no：1所示，lha的核苷酸序列如seq id no：7所示，p2a的核苷酸序列如seq id no：8所示，egfp的核苷酸序列如seq id no：9所示，t2a的核苷酸序列如seq id no：10所示，puro的核苷酸序列如seq idno：11所示，rha的核苷酸序列如seq id no：12所示。

7.一种用于精准编辑牛oct4的产物，其特征在于，所述产物包括sgrna、sgrna的引物、重组载体、donor质粒其中至少一种。

8.如权利要求7所述的一种用于精准编辑牛oct4的产物的应用，其特征在于，所述产物包括：试剂、试剂盒、芯片。

9.如权利要求7所述的一种用于精准编辑牛oct4的产物的应用，其特征在于，所述精准编辑牛oct4的方法，包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及基因工程和细胞工程技术领域，公开了一种用于精准编辑牛Oct4的sgRNA及其应用，包括一种用于精准编辑牛Oct4的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，还包括一种用于扩增sgRNA的引物，所述引物包括840位点引物、Oct4体外切割模板扩增引物和B840‑px330体外转录模板扩增引物。本发明用于精准编辑牛Oct4基因的sgRNA，针对牛OCT4基因第四外显子区域设计sgRNA，针对切割位点设计可实现高效同源重组的上、下游特异性同源臂；利用Crispr‑Cas9技术，靶向内源性Oct4特定位点进行精确切割，利用同源重组插入GFP，成功构建Oct4表达示踪报告系统，达到有效监测多能干细胞内源性Oct4表达的目的，可在后续开展定向诱导研究时，实时掌握细胞多能性的动态变化。

技术研发人员：赵芳,张瑀格,王慧利,曹少先,丁强,陈坤琳,夏淑雯,仲跻峰
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4