工程化大肠杆菌及其构建方法与应用

本发明涉及基因工程及生物医药，具体地说，涉及一种工程化大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、利用细菌进行癌症治疗是一种逐渐引起人们重视的癌症创新疗法。由于肿瘤具有特殊的微环境，传统疗法都很难起到很好的治疗作用，例如，化疗药物难以输送到肿瘤内部区域、容易出现脱靶效应；免疫疗法激发免疫细胞功能的敏感性强度不够等。而利用细菌治疗肿瘤具有很好的靶向性，并且不受肿瘤基因组等影响，具有突出的优点。并且，细菌靶向治疗肿瘤可以针对肿瘤细胞特异性蛋白和抗原等分子靶点，利用重组dna技术对菌株进行定向基因改造，表达肿瘤治疗相关药物、增加对肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤的作用效果。目前，已经被广泛研究的癌症治疗微生物有沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、志贺菌、李斯特菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等。其中，益生性大肠杆菌nissle 1917(ecn，是一种治疗慢性肠炎的药物，商品名是mutaflor，在德国等西方国家已使用多年)因其安全性较高、遗传操作容易、具有特异高效的肿瘤靶向性等特点，被广泛应用于炎性肠病治疗和癌症靶向治疗的研究中。

2、虽然ecn具有高效的肿瘤靶向性以及在肿瘤区域定殖的特性，但是其在肿瘤组织中的定殖比例大约为109cfu/g(参考文献：li r,helbig l,fu j,bian x,herrmann j,baumann m,stewart af,müller r,li a,zips d,zhang y.expressing cytotoxiccompounds in escherichia coli nissle 1917for tumor-targeting therapy.resmicrobiol.2019mar；170(2):74-79)，这么高的细菌使用量在应用过程中往往会引起较高的安全性担忧。因此，增强ecn在肿瘤组织中的定殖能力，降低细菌的使用数量，对开发肿瘤的细菌疗法至关重要。

3、ecn能够产生以硫酸乙酰肝素前体多糖(heparosan)为主要结构的荚膜多糖。虽然这种荚膜多糖能够帮助ecn抵抗血清中补体的攻击，增强体内免疫逃逸(参考文献：harimoto t,hahn j,chen yy,im j,zhang j,hou n,li f,coker c,gray k,harr n,chowdhury s,pu k,nimura c,arpaia n,leong kw,danino t.aprogrammableencapsulation system improves delivery of therapeutic bacteria in mice.natbiotechnol.2022aug；40(8):1259-1269.)。但是却没有研究证明其对ecn的肿瘤靶向性有帮助，因此有待提高细菌ecn靶向肿瘤组织的能力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种工程化大肠杆菌及其构建方法与应用。

2、本发明构思如下：为了提高大肠杆菌ecn靶向肿瘤组织的能力，利用基因工程方法对ecn表面荚膜多糖进行改造，将硫酸乙酰肝素前体多糖改变成为了透明质酸，使工程化的细胞对癌细胞具有较高黏附能力，从而可以减少肿瘤治疗时使用的细菌数量，进一步保证治疗的安全性。

3、ecn是目前唯一一株已知的益生性大肠杆菌，因其具有较高的安全性，已经被开发成为药物应用于炎症性肠病的治疗。但是近年来，研究者发现ecn能够定殖于一些肿瘤组织中，通过在细胞内表达细胞因子、抗肿瘤药物等而将其构建成为癌症治疗中的活菌递送系统。为了进一步增强ecn对癌细胞黏附性，本发明构建了一种工程化的大肠杆菌ecnδkfia-ab。与野生型ecn相比，工程化菌株ecnδkfia-ab对包括结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌症细胞的黏附性有了明显的增强。因此，工程化菌株ecnδkfia-ab具有应用于相关肿瘤治疗的潜力。

4、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种工程化大肠杆菌的构建方法，以大肠杆菌nissle 1917(ecn)为出发菌，通过基因工程改造得到；

5、改造方法包括：1)阻断硫酸乙酰肝素前体多糖的合成途径；以及2)引入透明质酸的合成途径。

6、进一步地，1)包括：敲除大肠杆菌ecn的kfia和/或kfic基因，获得基因敲除菌株。本发明中，kfia、kfic基因在ncbi上的参考序列编号分别为wp_000634338.1和wp_001305085.1。

7、进一步地，基因敲除的方法可选自同源重组、crispr、talen和zfn等中的任一种。

8、进一步地，2)包括：在所述基因敲除菌株中导入透明质酸合成酶基因；

9、优选地，所述透明质酸合成酶基因来自巴氏杆菌(pasteurella multocida)。此外，透明质酸合成酶基因还可以来源于鸡传染性鼻炎菌(avibacterium paragallinarum)、鸭源鸡杆菌(gallibacterium anatis)、埃希氏肠杆菌(escherichia)、紫色色杆菌(chromobacterium violaceum)、线杆菌(actinobacillus)、莫拉菌(moraxella)、奈瑟氏球菌(neisseria)、兽疫链球菌(streptococcus zooepidemicus)、假单胞菌(pseudomonas)、毛单胞菌(comamonas)和类马链球菌(streptococcu equisimilis)等。

10、进一步地，在所述基因敲除菌株中导入透明质酸合成酶pmuhasa和pmuhasb的基因。

11、其中，pmuhasa具有如seq id no:6所示的氨基酸序列；或seq id no:6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

12、pmuhasb具有如seq id no:7所示的氨基酸序列；或seq id no:7所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

13、在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

14、s1、透明质酸表达质粒pmal-c2x-ab的构建；

15、s1a、利用引物c2xf和c2xr从质粒pmal-c2x质粒(购自neb公司)扩增如seq id no:3所示的dna片段；

16、s1b、利用引物malhasabf和malhasabr2从巴氏杆菌扩增含有透明质酸合成酶pmuhasa和pmuhasb编码基因的dna片段；

17、s1c、将s1a、s1b所得dna片段通过gibson方法组装，得到透明质酸表达质粒pmal-c2x-ab；

18、s2、kfia基因敲除菌株nissle 1917δkfia(ecnδkfia)的构建；

19、s2a、将质粒pkd20(λ-red重组质粒；参考文献：gust,b.,challis,g.l.,fowler,k.,kieser,t.&chater,k.f.pcr-targeted streptomyces gene replacement identifiesa protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odorgeosmin.proc natl acad sci u s a100,1541-1546(2003).)导入大肠杆菌ecn，并制备感受态细胞；

20、s2b、利用引物tarkokfiaf和tarkokfiar从载体pij778(由英国john innescentre的keith chater教授惠赠，参考文献：gust,b.,challis,g.l.,fowler,k.,kieser,t.&chater,k.f.pcr-targeted streptomyces gene replacement identifies a proteindomain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.procnatl acad sci u s a100,1541-1546(2003).)扩增如seq id no:10所示的dna片段；

21、s2c、将s2b所得dna片段导入s2a的感受态细胞中，筛选转化子；

22、s2d、将质粒pcp20导入s2c的转化子中，得到kfia基因敲除菌株ecnδkfia；

23、s3、产生透明质酸的工程化大肠杆菌(ecnδkfia-ab)的构建；

24、将s1的质粒pmal-c2x-ab导入s2的菌株ecnδkfia中，筛选转化子，即得。

25、其中，引物c2xf和c2xr、引物malhasabf和malhasabr2、引物tarkokfiaf和tarkokfiar的序列分别如seq id no:1-2、seq id no:4-5、seq id no:8-9所示。

26、第二方面，本发明提供按照所述方法构建得到的工程化大肠杆菌。

27、第三方面，本发明提供一种抗肿瘤药物或组合物，其有效成分为所述工程化大肠杆菌。

28、第四方面，本发明提供所述工程化大肠杆菌的以下任一应用：

29、(1)用于制备胃肠功能障碍性疾病的治疗药物或组合物；

30、(2)用于制备肠道菌群调节剂；

31、(3)用于制备促进机体免疫因子分泌的调节剂；

32、(4)用于制备抗肿瘤药物或组合物；

33、(5)用于制备抗肿瘤和抗炎症药物的递送载体。

34、第五方面，本发明提供所述工程化大肠杆菌在肿瘤治疗中的应用。

35、所述肿瘤包括但不限于胃肠癌(如结肠癌)、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌等实体瘤。

36、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

37、本发明首次利用ecn作为宿主合成透明质酸，与野生型ecn相比，该工程化ecn细菌(菌株ecnδkfia-ab)在血清中具有更好的免疫逃逸能力，在消化系统具有更好的耐受性，对包括结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌细胞的黏附能力增强，可用于相关癌症治疗。