一种抗TIGIT免疫抑制剂及应用的制作方法

本发明涉及免疫学的。具体的说涉及免疫监测点抗体、其制备及免疫学方面的应用。

背景技术：

1、tigit(t cell immunoreceptor with ig and itim domains)是一种具有免疫球蛋白(ig)和酪氨酸抑制剂基序(itim)结构域的t细胞免疫受体，主要表达于激活的t细胞和nk细胞上(yu,x.,et al.(2009)."the surface protein tigit suppresses t cellactivation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendriticcells."nature immunology10(1):48-57.)。tigit也称为vsig9、vstm3和wucam，其结构显示包含一个细胞外免疫球蛋白结构域，一个1型跨膜区和两个itim基序。tigit是共同刺激网络的一部分，这个共刺激网络主要由t细胞上的激活性受体cd226和抑制性受体tigit，以及在apc、肿瘤细胞、感染的细胞表面表达的配体cd155(也称为pvr，一种在人类中被pvr基因编码的脊髓灰质炎病毒受体蛋白质)和cd112组成。tigit与pvr或cd112结合后会引起tigit胞质内tyr225被磷酸化，tigit和细胞自适应生长因子受体结合蛋白2(grb2)进行结合。grb2可以招募ship1抑制磷脂酰肌醇三激酶(pi3k)和促分裂原活化蛋白激酶(mapk)信号。除此之外，磷酸化的tigit通过beta抑制蛋白2(β-arrestin2)招募ship1和通过阻断tnf受体相关因子6(traf6)的自身泛素化破坏核因子kb(nf-kb)激活，一系列的信号传导最终导致t细胞或nk细胞的功能受到抑制，细胞因子的产生受到抑制。pvr既是tigit的配体，又是cd226分子的配体，cd226与pvr分子的亲和力为119nm。在和cd112或cd155结合之后，cd226的胞内结构域的ser329和tyr322被磷酸化。ser329磷酸化促进蛋白激酶(pkc)的激活和cd226与淋巴细胞关联抗原1(lfa1)的相互结合。lfa1然后被用于tyn介导的tyr322磷酸化和cd226介导的下游信号传导。一系列的信号传导最终导致t细胞或nk细胞的功能受到激活，促进细胞因子的产生。存在于t细胞或nk细胞表面的tigit分子与cd226分子之间也发生着相互作用，表现在tigit分子可以直接扰乱cd226形成正常的二聚体，从而破坏cd226的正常生理功能。由此可见，tigit和cd226如同天平的两端，通过pvr这个支点，通过共刺激和共抑制信号的传导巧妙的调节着机体的免疫功能。

2、tigit与自然杀伤(nk)细胞功能障碍的相关性研究表明，tigit与荷瘤小鼠以及结肠癌病人的nk细胞衰竭有关。在几个荷瘤小鼠模型中tigit被阻断可以阻止nk细胞衰亡并且促进nk细胞依赖的肿瘤免疫。此外，阻断tigit以一种nk细胞依赖的方式导致有效的肿瘤特异性t细胞免疫，在肿瘤再挑战模型中增强抗pd-l1抗体疗效和维持记忆免疫能力。这项工作表明，tigit构成了nk细胞表面以前未被重视的免疫检查点，并且单独或与其它检查点受体组合靶向tigit是一种有前景的抗癌治疗策略(zhang,q.,et al.(2018)."blockadeof the checkpoint receptor tigit prevents nk cell exhaustion and elicitspotent anti-tumor immunity."nature immunology.)。由于tigit既高表达于t细胞表面又高表达于nk细胞表面，而其它免疫检查点如：pd-1、ctla-4仅表达于t细胞表面，这就决定了tigit靶点作为治疗靶点具有更大的优势，因此开发此靶点的抗体药物也许具有很光明的治疗前景和市场前景。

技术实现思路

0、
技术实现要素：
概述

1、本发明提供一种对人tigit蛋白具有高亲和力的抗tigit抗体。在一些实施方案中，本发明的抗tigit抗体为分离的抗tigit抗体。在一些实施方案中，本发明的抗tigit抗体可以有效阻断tigit与pvr结合、也可以有效激活淋巴细胞释放细胞因子。在一些实施方案中，本发明的抗tigit抗体与人tigit的亲和力很高，并且有合适的adcc(antibody-dependent cellular cytotoxicity，抗体依赖的细胞毒性作用)活性。在一些实施方案中，本发明的抗tigit抗体可用于治疗各种类型的癌症以及感染等治疗目的，也可用于诊断和预后。

2、在一些实施方案中，本发明提供了一种的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，并且包含以下序列中的一个、两个、三个、四个、五个或全部：

3、(a)vh cdr1，含如seq id no：21所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

4、(b)vh cdr2，含如seq id no：22所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

5、(c)vh cdr3，含如seq id no：23所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

6、(d)vl cdr1，含如seq id no：25所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

7、(e)vl cdr2，含如seq id no：26或者43所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

8、(f)vl cdr3，含如seq id no：27所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列。

9、在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，并且包含：

10、(a)vh cdr1，含如seq id no：21所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

11、(b)vh cdr2，含如seq id no：22所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

12、(c)vh cdr3，含如seq id no：23所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

13、(d)vl cdr1，含如seq id no：25所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；

14、(e)vl cdr2，含如seq id no：43所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列；以及

15、(f)vl cdr3，含如seq id no：27所示的氨基酸序列，或其有单一位点的取代、缺失或插入的氨基酸序列。

16、在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，所述抗体或其片段包含如seq id no：21所示的vh cdr1、如seq id no：22所示的vh cdr2、如seq id no：23所示的vh cdr3、如seq id no：25所示的vl cdr1、如seq id no：26或者43所示的vl cdr2和如seq id no：27所示的vl cdr3中的一个、两个、三个、四个、五个或全部。

17、在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，所述抗体或其片段包含如seq id no：21所示的vh cdr1、如seq id no：22所示的vh cdr2、如seq id no：23所示的vh cdr3、如seq id no：25所示的vl cdr1、如seq id no：26或者43所示的vl cdr2和如seq id no：27所示的vl cdr3。

18、在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，所述抗体或其片段包含如seq id no：21所示的vh cdr1、如seq id no：22所示的vh cdr2、如seq id no：23所示的vh cdr3、如seq id no：25所示的vl cdr1、如seq id no：26所示的vlcdr2和如seq id no：27所示的vl cdr3。

19、在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其片段特异性结合有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的t细胞免疫受体(tigit)蛋白，所述抗体或其片段包含如seq id no：21所示的vh cdr1、如seq id no：22所示的vh cdr2、如seq id no：23所示的vh cdr3、如seq id no：25所示的vl cdr1、如seq id no：43所示的vlcdr2和如seq id no：27所示的vl cdr3。

20、在一些实施方案中，抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其组合。在一些实施方案中，轻链是κ或λ型。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ或λ链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是κ链恒定区。在一些实施方案中，轻链可变区是κ或λ链可变区。在一些实施方案中，轻链可变区是κ链可变区。在一些实施方案中，抗体或其片段是igg、igm、iga、ige或igd其中一种同种型。在一些实施方案中，同种型是igg1、igg2、igg3或igg4。在一些实施方案中，抗体或其片段是一种嵌合抗体、一种人源化抗体或是一种全人源抗体。在一些实施方案中，抗体或其片段是一种人源化抗体。

21、在一些实施方案中，所述抗体或其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、fc区或其结合。在一些实施方案中，所述fc区是人的fc区。在一些实施方案中，所述人fc区重链在356位(eu编号)的氨基酸为e。在一些实施方案中，所述人fc区重链在386位(eu编号)的氨基酸为m。在一些实施方案中，所述重链包含如seq id no：28或者29所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链包含如seq id no：30所示的氨基酸序列。

22、在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括重链可变区，所述重链可变区包含一条选自由seq id no：20、33、35、37、39、和41组成的组中的氨基酸序列，或一条与由seq idno：20、33、35、37、39、和41组成的组中的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的肽链。在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包含一条选自由seqid no：24、34、36、38、40和42组成的组中的氨基酸序列，或一条与选自由seq id no：24、34、36、38、40和42组成的组中的氨基酸序列至少有90％的序列同源性的肽链。

23、在一些实施方案中，所述抗体或其片段包括氨基酸序列如seq id no:35所示的重链可变区和氨基酸序列如seq id no:36所示的轻链可变区。

24、在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以有效阻断tigit与pvr结合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段可以激活淋巴细胞释放细胞因子。

25、在一些实施方案中，所述抗体或其片段与人tigit的亲和力数值kd≤100pm。在一些实施方案中，所述抗体或其片段与人tigit的亲和力数值kd≤5nm。

26、在一些实施方案中，所述抗体或其片段具有adcc活性。在一些实施方案中，所述抗体或其片段有结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述抗体或其片段没有结合岩藻糖。

27、另一方面，本发明还描述了一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含本发明所述的抗体片段和对免疫细胞上的分子具有特异性的第二抗原结合片段。所述分子包括pd-1、ctla-4、lag-3、cd28、cd122、4-1bb、tim3、ox-40、ox40l、cd40、cd40l、light、icos、icosl、gitr、gitrl、cd27、vista、b7h3、b7h4、hevm、btla、kir和cd47。

28、另一方面，本发明还提供了包含本发明公开的抗体或其片段的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于50％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于30％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于20％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于10％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于5％的抗体或其片段结合岩藻糖。在一些实施方案中，所述组合物中小于或等于1％的抗体或其片段结合岩藻糖。

29、另一方面，本发明还提供了一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸可编码所述的抗体或其片段。在一些实施方案中，编码抗体重链的多聚核苷酸的序列如seq id no:46所示；在一些实施方案中，编码抗体轻链的多聚核苷酸的序列如seq id no:47所示。

30、另一方面，本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含编码本发明公开的抗体或其片段的一个或多个多聚核苷酸。

31、另一方面，本发明还提供了一种制备所述的抗体或其片段的方法，其特征在于，培养包含编码该抗体或其片段的多聚核苷酸的细胞以表达该抗体或其片段。在一些实施方案中，所述细胞为cho细胞、hek293细胞、cos1细胞、cos7细胞、cv1细胞或鼠l细胞。

32、另一方面，本发明还提供了治疗方法和用途。在一些实施方案中，本发明提供了在有需求的患者中治疗癌症或感染的方法，包括向患者施用有效剂量的本发明公开的抗体或其片段。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，所述癌症可以是膀胱癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、结肠直肠癌、头颈癌、鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用第二种癌症治疗剂。在一些实施方案中，所述感染是病毒感染，细菌感染，真菌感染或寄生虫感染。

33、在一些实施方案中，本发明提供了在有需求的患者中治疗癌症或感染的方法，包括：(a)在体外，用本发明公开的抗体或其片段处理细胞；和(b)将处理过的细胞施用到患者体内。在一些实施方案中，该方法进一步包括，在步骤(a)之前，从个体中分离细胞。在一些实施方案中，从患者体内分离细胞。在一些实施方案中，从区别于患者的供体个体分离细胞。在一些实施方案中，所述细胞是t细胞，其非限制性实例包括肿瘤浸润t淋巴细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞，或其组合。

34、在一些实施方案中，本发明还提供了抗tigit抗体或其片段在制备用于在有需要的患者中治疗癌症或感染的药物中的应用。在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自膀胱癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿道癌、头颈癌、胃肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，还包括向所述患者施用第二种癌症治疗剂。在一些实施方案中，感染是病毒感染、细菌感染、真菌感染或寄生虫感染。

35、在一些实施方案中，本发明还提供一种细胞在制备用于治疗癌症或感染的药物中的应用，所述应用包括：(a)在体外，用抗体或其片段处理所述细胞，和(b)将处理后的所述细胞施用于患者体内。在一些实施方案中，所述方法在步骤(a)之前还包括从个体分离出所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞从所述患者体内分离出来。在一些实施方案中，所述细胞从不同于所述患者的供体个体中分离出来。在一些实施方案中，所述细胞是t细胞。在一些实施方案中，所述t细胞是肿瘤浸润性t淋巴细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞或其组合。

36、另一方面，本发明还提供了诊断方法和用途。在一些实施方案中，本发明提供了检测样品中tigit的表达的方法，包括使样品与抗体或其片段在一定条件下接触，使得抗体或其片段与tigit结合，并检测其结合，即样品中tigit的表达。在一些实施方案中，所述样品包括肿瘤细胞、肿瘤组织、被感染的组织或血液样品。