一种高通量微流控系统及单细胞筛选方法与流程

本发明属于单细胞分析筛选、微流控技术及大数据人工智能领域，涉及一种单细胞分析筛选与深度表征的方法,具体涉及一种高通量微流控系统及单细胞筛选方法。

背景技术：

1、细胞在特定疾病和微环境下，会展现出独特的、高异质性的细胞形貌。例如，在癌症中，细胞通常会呈现出异常的形状、大小和排列方式，来帮助它们快速分裂并侵入周围组织。除了癌症，其他疾病也存在特定的细胞形态学表现。例如，在阿尔茨海默病中，大脑神经元会形成交织的、错误折叠的蛋白质，导致大脑神经元细胞的功能和通信受到破坏。在囊性纤维化疾病中，呼吸道内皮细胞产生厚重粘稠的黏液，堵塞呼吸道，导致慢性肺部感染。在自身免疫性疾病中，免疫细胞会攻击健康细胞和组织，导致炎症和组织损伤。如红斑狼疮患者的免疫细胞会攻击皮肤、关节和肾脏组织。上述与疾病相关的细胞形态学变化可以通过病理学检查或显微镜直接观察到，并可用于诊断、治疗以及研究疾病的机制和治疗方法的开发，寻找新的治疗靶点，并开发出更有效的治疗方法。

2、通过构建细胞形貌与细胞对应疾病状态之间的映射关系，能够实现“看(细胞)形貌，知疾病”，在循环肿瘤细胞(ctc)检测、恶性肿瘤早筛、临床体外诊断等领域有巨大的医学意义及应用前景。要实现基于细胞形貌的精准快速疾病检测，关键在于高通量高分辨率的单细胞成像与检测以及可实现单细胞特性深度表征及构建高鲁棒性细胞形貌-对应疾病映射关系的智能化技术。首先，癌症等恶性疾病的早期筛查须精确至单细胞分辨率。在癌症等恶性疾病早期，外周血中只有痕量(少于百万分之一)癌变细胞存在。传统癌症检测手段是基于外周血中所有细胞指标的统计平均进行临床诊断，病变细胞的特性被其它大部分正常细胞所淹没，因此癌症早期症状不明显，诊断困难，病例一经发现常处于恶性肿瘤晚期，错过最佳诊疗期且愈后较差。单细胞检测分析技术对外周血中每个细胞都进行成像、分析及表征，显著提高早期筛查的成功率。由于每毫升血液中存在数百万个细胞，需要引入高通量检测成像技术保证单细胞分析的效率。其次，单细胞分析检测采集的大量图像数据以及每个细胞对应的不同健康状态产生了庞大的数据量和复杂的特征关系，要实现单细胞特性深度表征及构建高鲁棒性细胞形貌-对应疾病映射关系，必须借助智能化手段。

3、目前的单细胞分析检测研究和应用，仍主要基于流式细胞仪技术。在流式细胞仪中，细胞被流体送至激光照射区。当细胞经过激光照射时产生前向和侧向散射光，分别包含了细胞的外形和内部颗粒度的信息。被荧光标记的细胞还会表现出荧光特性。通过对散射光信号设门能够确定样本中各细胞亚群，而通过荧光信号能够确定被特异性标记的单个细胞的类别。细胞筛分的高通量性与高精准性之间的相互制约是传统流式细胞筛分技术的发展瓶颈，如何实现细胞高通量筛分的同时保证筛分的精准性是当前学术界的研究热门。一方面，传统流式细胞仪只包含单一微流通道，要实现细胞高通量流动，只能通过提高细胞流速及缩小细胞间距。当细胞流经微流控通道的激光照射区域时，激光束穿过多个细胞，导致传感器采集的数据是多个细胞的平均、非特异数据；而穿过单个细胞的激光通量减少，检测分辨率降低，细胞多级结构细节信息丢失，最终造成细胞筛分的精确性降低。相反，要提升细胞筛分的精准性，需要降低细胞流速、增大细胞间距，保证单细胞依次通过激光束。而这会导致细胞流动通量减少，细胞检测筛分速度降低。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明要解决的技术问题是：本发明针对目前常规流式细胞仪技术无法有效解决细胞高通量筛分的同时保证筛分精准性的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种高通量微流控系统，包括由样品驱动单元和微流控芯片构成的微流控结构、倒置荧光显微镜、可编程门阵列fpga、可移动工作站和用于自动对焦校准的微流控结构升降控制器；所述样品驱动单元包括：并列设置在样品外周血微注射泵和微注射泵；所述微流控芯片包括：样品外周血注入口、粘弹性溶液注入口、主微通道和流体参数传感器；样品外周血注入口和粘弹性溶液注入口在主微通道的前端部分交汇，主微通道上连通有用于收集目标细胞的分支微通道一和用于收集非目标细胞的分支微通道二，分支微通道一和分支微通道二上均设有微流体阀；所述流体参数传感器的检测端设置在主微通道内，流体参数传感器的信号输出端与可移动工作站的信号输入端连接；可编程门阵列fpga通过微流控平台升降控制器控制电路连接并控制微流控结构升降控制器，通过微流体阀控制电路连接并操控微流体阀的开启和关闭；可移动工作站用于接收信号和发射指令。

3、作为优选，还包括用于检测分支微通道一和分支微通道二中流体的流速、压强、温度、粘度和ph值信号的微通道流体参数传感器，微通道流体参数传感器将检测的信号传至可移动工作站。

4、一种单细胞筛选方法，采用上述所述的高通量微流控系统，包括如下步骤：

5、s1：构建ai视觉特征引擎：该ai视觉特征引擎是以卷积神经网络cnn及循环神经网络rnn为基础进行构建的混合神经网络视觉模型，所述混合神经网络视觉模型存储在可移动工作站中。

6、s2：对混合神经网络视觉模型进行训练：倒置荧光显微镜拍摄的主微通道内的流动的单细胞序列图像经过图像分割、图像增强、卷积和池化操作后，形成提质化图像数据集，提质化图像数据集作为混合神经网络视觉模型的原始输入。

7、对提质化图像数据集中的每个单细胞图像打上有“目标细胞”和“其它对象”的标签获得数据集，将数据集中的80％样本作为训练集，确保输入混合神经网络视觉模型中标有“目标细胞”和标有“其它对象”的样本数量基本相同。

8、预设最大训练次数，基础学习率和最低学习率对混合神经网络视觉模型进行训练得到训练好的混合神经网络视觉模型。

9、s3：将测试集中的样本输入s2训练好的混合神经网络视觉模型中，输出为图像分类结果，单细胞中心线偏移量和样品质量。

10、s4：当经过ai响应时间后，通过微流体阀开关触发器向样品驱动单元和可编程门阵列fpga输出操作信号，控制样品驱动单元或微流体阀的开启和关闭；所述ai响应时间＝单细胞从倒置荧光显微镜至微流体阀的位移/单细胞流速。

11、s5：对于待预测的血液样本输入高通量微流控系统，通过倒置荧光显微镜采集主微通道内的流动的单细胞序列图像，该单细胞序列图像经过图像分割、图像增强、卷积和池化操作后输入训练好的混合神经网络视觉模型，输出图像分类结果。

12、作为优选，所述s1中混合神经网络视觉模型采用了inception v3模型，模型输入为倒置荧光显微镜拍摄的单细胞图像，输入尺寸11：299×299×3，即对应于单细胞图像299×299的分辨率及3个图像通道。

13、作为优选，所述s2对混合神经网络视觉模型进行训练时，在损失函数中加入正则化约束。

14、相对于现有技术，本发明至少具有如下优点：

15、1.本发明通过微流控、多通道、多细胞成像提升细胞筛分通量，而精准流动控制、多级结构细胞成像及物理约束ai模型保证筛分的精确性，可良好的解决传统流式细胞仪技术高通量性与高精准性的相互约束，有助于对痕量异常细胞早期精准、快速、智能检测。

16、2.本发明能够对外周血样品进行单细胞全覆盖分析，基于微流控技术实现单细胞高通量检测，保证检测效率，并基于高速高分辨成像设备对微通道中高速流动的单细胞进行高清高内涵成像，为ai视觉特征引擎提供高质量图像数据集。

17、3.本发明将输入的图像数据、时序数据及物理参数与细胞对应的疾病状态进行深度表征与高鲁棒关联，构建高精度单细胞智能分析检测模型，在单细胞高通量流动场景下对异常细胞进行精准识别并快速向微流控平台发送响应对异常细胞进行筛分，打破了传统流式细胞仪技术高通量性与高精准性的相互约束。

18、4.本发明引入了一种无生物标记的单细胞识别与筛分方法，相比于传统生物标记法，本方法能够避免生物标记对细胞产生的毒性及改性伤害，保持细胞的完整活性，这对于下游的基因水平和蛋白水平的分析至关重要。

19、5.本发明引入了一种单细胞多组学信息嵌入的ai引擎强化训练方法，针对微环境改变导致细胞异常响应影响细胞形貌的场景，通过嵌入单细胞多组学信息及微流体参数，使ai引擎的检测识别精度不被细胞微环境改变引入的误差所影响，进一步保证ai引擎的高精度及高鲁棒性。