一株总状横梗霉及其固态发酵产果胶酶的方法

本发明属于微生物，具体涉及一株总状横梗曲霉及其固态发酵产果胶酶的方法。

背景技术：

1、果胶酶是水解酶家族的一员，是一类能够降解果胶分子的多种酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶（pg）、原果胶酶、果胶甲酯酶（pe）、果胶裂解酶（pl）和纤维素酶等，这些酶能够裂解糖苷键、脱支链或修饰果胶。 另外这些酶作用于o-α-（1,4）多聚吡喃半乳糖结构，其活性和特异性部分取决于甲基化程度。原果胶酶溶解原果胶并形成可溶性果胶，从而切断阿拉伯糖和聚甲氧基半乳糖醛酸之间的化学键；果胶甲基酯酶和果胶乙酰酯酶从果胶中消除甲氧基和乙酰基残基，从而产生聚半乳糖醛酸；聚半乳糖醛酸酶通过水解和反式消除反应破坏半乳糖醛酸残基之间的糖苷α-（1,4）键，水解成更小的分子，使其凝聚并沉降分离；纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与其他成分的接触面积，促进果胶等大分子的分解，在果汁澄清、酿酒、榨汁等食品行业广泛应用。此外果胶酶还在环境、饲料、医药、生物燃料等领域有所发展。果胶酶根据ph分为酸性和碱性两类。

2、果胶酶有许多来源，在自然界中分布广泛。果胶酶不同来源是植物、细菌、真菌、酵母和原生动物等。由于微生物生长快、广泛多样、发酵时间短和更容易获得的基因修饰，微生物来源是重要的。据报道，35%的果胶酶来自细菌，55%来自真菌，只有15%的来自植物或动物来源。而许多研究都与高质量的果胶酶有关，随着对果胶酶的需求不断增加，研究果胶酶成为当代的热点。但是国内的发展缓慢且仅限于果胶酶的单一使用，这限制了果胶酶的应用范围。因此，寻找一种能高效降解果胶的新型产果胶酶菌株可为更好地开发利用果胶提供新资源。

3、在微生物发酵工业中，菌种是直接决定产品质量和产量是否达标的关键性因素。本发明从常州市武进区郊区采集土样，经过筛选、培养、鉴定、发酵初步优化，最后获取了一株产果胶酶的总状横梗霉lichtheimia sp.x-8。为菌种领域增添新菌种。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一株总状横梗霉及其固态发酵产果胶酶的方法，从常州市武进区郊区采集的桃园、水稻田、青菜田、马铃薯土壤经过特定的筛选培养基分离纯化，最后依据十六烷基三甲基溴化铵（ctab）方法筛选出有透明圈的菌株，通过分子生物学鉴定，确认筛选的是总状横梗曲霉，命名为lichtheimia sp.x-8，为菌种领域增添了新菌种。该菌株横梗霉 lichtheimia sp.x-8已于2023年11月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：cgmcc no . 40909。

2、本发明一方面提供了一株总状横梗霉，该菌株的筛选方法如下：

3、（1）菌株筛选

4、分别称取桃园、水稻田、青菜田、马铃薯土壤1g放入无菌蒸馏水中，28℃，160r/min恒温摇床富集过夜，采用稀释涂板法稀释至103，取100μl涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株；采用单点法将纯种菌株接种在果胶培养基平板上，待菌株长出后，用ctab溶液对菌株进行染色，再用无菌氯化钠溶液进行洗脱，观察菌株透明圈，测量产生透明圈的菌株直径（h）和透明圈直径（c），计算h/c的比值，选择产生透明圈比值大的的菌株进行下一步的复筛；

5、其中，果胶酶筛选培养基：果胶0.8g、nh4cl 0.04g、mgso4·7h2o 0.2g、k2hpo4 0.001g、h2o 100ml、ph7.0，琼脂2g，121℃灭菌20min；

6、（2）孢子悬液制备

7、将（1）产生透明圈的菌株转接到pda固体培养基上，28℃培养3d，用适量的无菌水将总状横梗霉孢子洗脱下置于已灭菌的含有玻璃珠的锥形瓶中充分震荡，使孢子充分打散，取无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液。利用血球计数板在显微镜上观察，计算孢子个数，用无菌生理盐水稀释，致使最终的孢子悬液浓度为1.0×106个/ml；

8、其中，pda固体培养基成分：土豆200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，115℃灭菌30min

9、（3）取（2）制备的孢子悬液取4.5%接种于固态发酵培养基中，测定果胶酶酶活力，并对其进行分子生物学鉴定，鉴定为横梗霉属，命名为lichtheimia sp.x-8；其中，固体发酵培养基成分：麸皮35g，酵母膏5g，h2o 60ml, ph4.5，121℃灭菌20min。

10、本发明另一方面提供了上述总状横梗曲霉固态发酵产果胶酶的方法，具体步骤如下：

11、以筛选出的总状横梗霉lichtheimia sp.x-8菌株为出发菌株，对其进行固态发酵培养基优化；

12、固态发酵培养基成分：以麸皮为碳源，酵母膏为氮源，且麸皮与酵母膏比例为：36:4-28:12；以k+、na+、ca2+、mg2+、ba2+、fe2+、mn2+为金属离子，金属离子浓度为0.4%-1.2%；含水量为培养基总质量的40%-70%。

13、固态发酵条件如下：培养ph4.0-7.0，温度为22℃-34℃。接种量为1.5%-6.5%。装料量为30g-90g。

14、最优固态发酵培养基成分：麸皮与酵母膏比例为35:5，mg2+添加量为0.8%，含水量为培养基总质量的45%。

15、最优发酵条件：培养时间为4d，发酵ph为5.5，温度为25℃，接种量为2.5%，装料量为70g。

16、本发明有益的技术效果在于：本发明从不同土壤里利用ctab染色法筛选出产果胶酶的总状横梗曲霉菌株，其总状横梗曲霉可广泛应用果胶酶的生产，具有广泛的应用前景。利用固态发酵，可有利的减少生产成本，且操作过程简便、能耗低，微生物易生长，不易产生大面积的污染等优点。

技术特征：

1.一株总状横梗霉，其特征在于，所述总状横梗霉的分类命名为横梗霉属lichtheimia sp.x-8，已于2023年11月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no . 40909。

2.一种如权利要求1所述的总状横梗霉在固态发酵生产果胶酶中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，固态发酵培养的温度为22-34℃，培养时间为2-6天，培养基ph4.0-7.0。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，固态发酵培养基包括麸皮、酵母膏、金属离子和水，其中金属离子的质量浓度为0.4%-1.2%，水的含量为40%-70%，其余为麸皮和酵母膏。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，固态发酵培养基中，酵母膏占麸皮和酵母膏总质量的2.5%-10%。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述金属离子选自k+、na+、mg2+、ba2+中的一种或多种。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，固态发酵培养基的装料量为：500ml锥形瓶中装入培养基30-90g。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，固态发酵培养的菌种接种量为1.5%-6.5%。

9.一种如权利要求1所述的总状横梗霉的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：称取土壤放入无菌蒸馏水中，28℃，160r/min恒温摇床富集过夜，采用稀释涂板法稀释后涂布于果胶培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置培养，待菌株长出后，用平板划线法分离纯化菌株，依据十六烷基三甲基溴化铵方法筛选出有透明圈的菌株，进行分子生物学鉴定，确认所筛选的菌株为总状横梗霉；所述果胶培养基组成为：果胶8g/l，nh4cl 0.4g/l，mgso4·7h2o 2g/l，k2hpo4 1g/l，feso4·7h2o 0.01g/l，琼脂20g/l，ph7.0。

技术总结
本发明公开了一株总状横梗曲霉及其固态发酵产果胶酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过从不同土壤中筛选出产果胶酶性能较好的菌株经分子生物学鉴定为总状横梗霉Lichtheimia sp.X‑8，保藏编号为CGMCC No.40909，该菌株可以广泛应用于果胶酶的生产。

技术研发人员：蔡志强,刘婷婷,李颜辰,岳纹龙,敖大,杨广花
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24