与抗菌肽LL-37进行融合表达的重组抗菌肽及其制备方法和应用

本发明属于基因工程技术和生物发酵，特别是涉及与抗菌肽ll-37进行融合表达的重组抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、抗菌肽(antibacterial peptide，amp)又被称为宿主防御肽，是先天免疫系统的一种小分子多肽，是由12-100个氨基酸组成的两亲性a螺旋的阳离子抗菌肽，具有广谱抗菌活性，与传统抗生素相比不易产生耐药性，因此极有可能成为替代抗生素的首选药物，为人体抵御病原入侵提供了第一道防线。人体内主要产生两大类抗菌肽：defensin家族肽和cathelicidin家族肽，其中cathelicidin肽是一类能够抑制蛋白酶cathepsin-l，具有抗微生物作用的肽家族蛋白。

2、抗菌肽ll-37是人体cathelicidin家族的唯一成员，因其n端前含有两个亮氨酸残基(l)，且由37个氨基酸组成而得名ll-37。ll-37可在人体各组织器官中表达，特别是在消化道、皮肤、泌尿道和口腔上皮细胞中。此外，它也表达在一些伤口渗出液、汗液和血液中。ll-37的主要合成部位为中性粒细胞，可由巨噬细胞、单核细胞、角蛋白细胞、中性粒细胞等进行分泌，其分成cathelin结构域、信号肽及活性肽三个部分，氨基酸序列为llgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes，分子的中央部分残基形成典型的双亲性a螺旋结构，具有线性结构，无二硫键，含有6个静正电荷，n末端疏水性很高，分子量为4.5kda，属于阳离子抗菌肽。作为天然免疫系统的重要成员，ll-37对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都能起到抗菌作用，包括大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌等。

3、其中空肠弯曲菌是一类革兰氏阴性的微需氧细菌，是世界范围内重要的食源性病原菌。其在家禽及相关产品中广泛存在，容易通过家禽传染给人，可引起人类急性肠炎、格林巴利综合征和反应性关节炎等多种疾病。对于弯曲菌的防控，目前主要通过在家禽饲养过程中添加抗生素进行预防性治疗，然而，由于家禽养殖过程中抗生素的滥用，弯曲菌的耐药问题日趋严重，多重耐药菌的出现更是严重影响了人弯曲菌病的治疗。针对弯曲菌耐药问题，使用抗菌肽防控弯曲菌的研究再次兴起。研究发现抗菌肽ll-37对空肠弯曲菌有一定的抑制作用，其抑菌活性还需要进一步探究。

4、由于生物体内提取纯化的天然抗菌肽ll-37来源有限，利用固相肽合成(spps)法等化学合成成本较高，因此利用基因工程技术提高其产量更具发展前景。但是抗菌肽ll-37在进行原核表达时易对宿主菌产生毒性，且蛋白易发生不正确折叠，蛋白产量也较低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于采用融合表达的策略，提供与抗菌肽ll-37进行融合表达的重组抗菌肽及其制备方法和应用，并通过发酵工艺优化提高ll-37的蛋白产量和抑菌活性，降低其生产成本，推进其大规模生产，为解决日益严重的细菌多重耐药性问题提供新型防控方法。

2、为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

3、与抗菌肽ll-37进行融合表达的重组抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：采用抗菌肽ll-37与麦芽糖结合蛋白mbp进行融合表达，并在mbp和ll-37之间添加linker序列促进其共表达，得到重组抗菌肽mbp-ll-37。

4、所述重组抗菌肽mbp-ll-37的序列如下：

5、mkieegklviwingdkgynglaevgkkfekdtgikvtvehpdkleekfpqvaatgdgpdiifwahdrfggyaqsgllaeitpdkafqdklypftwdavryngkliaypiavealsliynkdllpnppktweeipaldkelkakgksalmfnlqepyftwpliaadggyafkyengkydikdvgvdnagakagltflvdliknkhmnadtdysiaeaafnkgetamtingpwawsnidtskvnygvtvlptfkgqpskpfvgvlsaginaaspnkelakeflenylltdegleavnkdkplgavalksyeeelvkdpriaatmenaqkgeimpnipqmsafwyavrtavinaasgrqtvdealkdaqtggggsggggsggggsllgdffrkskekigkefkrivqrikdflrnlvprtes。

6、进一步的，合成编码抗菌肽ll-37的dna序列，并采用大肠杆菌偏好的密码子对序列进行优化，优化后的核苷酸序列如seq id no:2所示。

7、进一步的，所述制备方法包括以下步骤：

8、将融合蛋白mbp的pcr扩增产物连接到含有ll-37编码基因的原核表达载体pet-28a(+)中，构建得到含ll-37编码基因的重组载体pet28a-mbp-ll-37；

9、将重组载体转化至bl21(de3)菌株中，诱导并纯化，得到重组抗菌肽mbp-ll-37。

10、进一步的，重组载体转化至bl21(de3)菌株中后，接种于含卡那抗性的lb培养基中。

11、进一步的，诱导条件为37℃，诱导时间为8h，诱导剂浓度为0.2mmol/l。

12、进一步的，所述lb培养基中，碳源为甘油，氮源为2:1的蛋白胨和酵母粉；所述lb培养基中添加0.4g/l mg2+。

13、进一步的，对融合蛋白mbp进行pcr扩增的引物序列为：

14、mbp-f:cagcaaatgggtcgcggatccatgaaaatcgaagaaggtaaactg；

15、mbp-r:gcaagcttgtcgacggagctcagtctgcgcgtctttcaggg。

16、进一步的，纯化步骤为：先大量诱导目的蛋白，然后高压破碎菌体沉淀后离心并收集上清和沉淀，采用ni柱亲和层析法纯化所述上清液，获得纯化后的重组抗菌肽mbp-ll-37。

17、本发明还提供一种与抗菌肽ll-37进行融合表达的重组抗菌肽，所述重组抗菌肽由上述制备方法制备而成。

18、本发明还提供与抗菌肽ll-37进行融合表达的重组抗菌肽在制备抑制家禽空肠弯曲菌制剂中的应用。

19、本发明还提供一种高效表达抗菌肽ll-37的方法，该方法包括以下步骤：

20、1.获取抗菌肽ll-37的编码基因：根据genbank公布的抗菌肽ll-37的序列，采用大肠杆菌偏好的密码子对序列进行优化并送生工生物工程(上海)有限公司进行基因合成。

21、2.构建重组载体：将融合蛋白mbp的pcr扩增产物连接到克隆载体pet28a-ll-37中，构建得到重组质粒pet28a-mbp-ll-37。

22、3.表达抗菌肽ll-37：将重组表达载体转化至bl21(de3)菌株中，利用iptg诱导后收集包含抗菌肽ll-37的细菌，超声裂解后利用western blot鉴定目的蛋白的表达情况。

23、4.诱导条件优化：对诱导温度、时间和iptg浓度进行优化并用tricine sds-page进行鉴定。重组蛋白的最佳诱导条件为37℃，8h，iptg 0.2mmol/l；

24、5.发酵条件优化：在lb培养基的基础上添加不同的碳源、氮源和金属离子，western blot鉴定后发现在lb培养基中添加甘油和mg2+有利于目的蛋白的表达，通过蛋白灰度分析和响应面优化后得到甘油的最优添加量为10g/l，mg2+的最佳添加量为0.4g/l。

25、6.纯化抗菌肽ll-37：先大量诱导目的蛋白，然后高压破碎菌体沉淀后离心并收集上清和沉淀，采用ni柱亲和层析法纯化所述上清液，获得纯化后的抗菌肽mbp-ll-37。

26、7.抑菌活性测定：利用微量稀释法测定ll-37对空肠弯曲菌标准株81-176的抑菌活性。

27、有益效果

28、通过密码子优化、启动子选择、mbp融合表达、诱导条件和发酵条件优化，得到重组抗菌肽mbp-ll-37，将蛋白产量提高到28.8mg/l；

29、融合蛋白mbp降低了ll-37对细胞的毒性，帮助蛋白质正确折叠，促进蛋白质可溶性表达，方法简单易行，获得的重组抗菌肽在纯化后不经任何处理即具有明显的体外抑菌效果，对空肠弯曲菌标准株81-176的抑菌活性为4.2μm；

30、本发明建立了一种高效的融合表达方法，融合蛋白mbp可以促进ll-37的正确折叠和可溶性表达且本身没有抑菌活性，并对发酵培养基进行了优化，利用优化后的培养基进行发酵罐放大试验，可以提高蛋白产量和抑菌活性，便于扩大规模生产和推广，为弯曲菌的防控提供新策略。采用原核表达系统生产抗菌肽ll-37的方法简单易行，能有效降低生产成本，为ll-37的工业化生产提供了指导。