抗CD34抗体及其制备和应用的制作方法

本发明属于抗体领域，具体涉及抗cd34抗体及其制备和应用。

背景技术：

1、cd34抗体作为一种靶向cd34抗原的单克隆抗体，在干细胞学、造血系统疾病治疗以及肿瘤学等领域具有重要意义。cd34抗原是一种表面抗原，主要存在于干细胞和内皮祖细胞中，并且在造血系统中起到了关键的调节作用。因此，针对cd34抗原的抗体被广泛用于干细胞移植、骨髓移植、干细胞分离和肿瘤治疗等临床应用。

2、在过去的研究中，通过使用合成的cd34肽段免疫balb/c小鼠，成功开发了针对cd34抗原的单克隆抗体。这些抗体在elisa、免疫荧光、西方印迹和流式细胞术等不同的免疫学检测中显示出高度的特异性和功能性(maleki et al.,2013)[1]。此外，通过在小鼠腹膜中大规模生产这些抗体，研究人员能够为白血病的诊断和人类造血干/祖细胞的纯化提供了一种有力的工具(majidi et al.,2013)[2]。cn 114426579 a提供的抗人cd34嵌合抗体对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有重要意义，小鼠抗人cd34抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达载体，两者重组后表达产生的抗cd34嵌合抗体，能够特异性结合人cd34分子并能够降低鼠源性抗人cd34抗体的背景及免疫源性。cn114457038a提供了一种利用cd34抗体与磷脂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯缀合后与分泌型外泌体表面的结合以合成具有高内皮细胞靶向特性的外泌体载体，进而将smad7基因加载到该外泌体载体中，制备出了一种新型的载基因外泌体，为异位骨化的靶向治疗提供了新的临床前研究策略。

3、因此，针对cd-34抗体及其应用的专利技术研究具有重要的科学意义和临床应用前景。通过进一步的研究和创新，有望克服现有解决方案的局限性，为干细胞治疗、造血系统疾病诊断和肿瘤治疗等领域带来更加可靠和有效的解决方案。

4、[1]maleki,l.,majidi,j.,baradaran,b.,abdolalizadeh,j.,&akbari,a.(2013).production and characterization of murine monoclonal antibody againstsynthetic peptide of cd34.human antibodies,22(1-2),15-21.doi:10.3233/hab-130265.

5、[2]majidi jafar,b.behzad,aghebati maleki leili,a.jalal,&movassaghpouraliakbar.(2013).mass-production and characterization of anti-humancd34monoclonal antibody in peritoneum of balb/c mice.frontiers in immunologyconference abstract:15th international congress of immunology.doi:10.3389/conf.fimmu.2013.02.00001.

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种抗人cd34抗体的具体氨基酸序列，通过该序列可以利用现有技术获得表达抗人cd34抗体的基因工程细胞，提高了cd34抗体的产率和生产稳定性，并且该抗体亲和力高，特异性强，有望用于制备抗肿瘤、造血系统疾病的诊断和治疗药物。

2、术语：

3、本发明中，cdr(complementarity-determining regions，cdr)叫做互补决定区或互补决定簇。它位于免疫球蛋白的超变区，超变区是抗体的抗原结合位，与抗原决定簇的结构互补。一般包括cdr1、cdr2、cdr3。

4、本发明中，可变区指免疫球蛋白轻链和重链靠近n端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。

5、本发明中，重链指抗体中2条较长、相对分子量较大的相同的重链(h链)；轻链指抗体中2条较短、相对分子量较小的相同的轻链(l链)。

6、本发明中，相似性指同源蛋白质的氨基酸序列中一致性和可取代氨基酸所占的比例。

7、本发明中，单克隆抗体指由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

8、本发明中，鼠源化抗体指将来源于免疫接种过的小鼠的b细胞与骨髓瘤细胞融合，得到的鼠杂交融合细胞分泌的抗体。

9、一方面，本发明提供了一种抗人cd34抗体，所述的抗人cd34抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链链可变区，所述的轻链包括轻链可变区；所述的重链可变区包括hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述的轻链可变区包括lcdr1、lcdr2、lcdr3，其中：

10、(1)hcdr1为seq id no.1所示的氨基酸序列，或seq id no.2所示的氨基酸序列；

11、(2)hcdr2为seq id no.3所示的氨基酸序列，或seq id no.4所示的氨基酸序列；

12、(3)hcdr3为seq id no.5所示的氨基酸序列，或seq id no.6所示的氨基酸序列；

13、(4)lcdr1为seq id no.7所示的氨基酸序列，或seq id no.8所示的氨基酸序列；

14、(5)lcdr2为seq id no.9所示的氨基酸序列；

15、(6)lcdr3为seq id no.10所示的氨基酸序列，或seq id no.11所示的氨基酸序列。

16、具体地，所述的抗人cd34抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.12或与seqid no.12具有80％以上序列相似性的序列；

17、或所述的抗人cd34抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no.13或与seq idno.13具有80％以上序列相似性的序列；

18、所述的抗人cd34抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.14或与seq id no.14具有80％以上序列相似性的序列；

19、或所述的抗人cd34抗体轻链可变区的氨基酸为seq id no.15或与seq id no.15具有80％以上序列相似性的序列。

20、优选地，所述的抗人cd34抗体重链可变区氨基酸序列为seq id no.12或seq idno.13；轻链可变区氨基酸序列为seq id no.14或seq id no.15。

21、具体地，所述的抗人cd34抗体重链氨基酸序列为seq id no.16，或与seq idno.16具有65％以上序列相似性的序列；

22、或所述的抗人cd34抗体重链氨基酸序列为seq id no.17，或与seq id no.17具有65％以上序列相似性的序列；

23、所述的抗人cd34抗体轻链氨基酸序列为seq id no.18，或与seq idno.18具有65％以上序列相似性的序列；

24、或所述的抗人cd34抗体轻链氨基酸序列为seq id no.19，或与seq id no.19具有65％以上序列相似性的序列。

25、优选地，所述的抗人cd34抗体重链氨基酸序列为seq id no.16或seq id no.17，轻链氨基酸序列为seq id no.18或seq id no.19。

26、具体地，所述的抗人cd34抗体为单克隆抗体；优选为鼠源化抗体。

27、另一方面，本发明提供了表达前述的抗人cd34抗体的核苷酸序列。

28、所述的核苷酸序列可以是通过密码子简并性优化后的序列，用于编码前述的抗人cd34抗体均可。

29、优选地，重链seq id no.16和seq id no.17对应的核苷酸序列分别为seq idno.20和seq id no.21，轻链seq id no.18和seq id no.19对应的核苷酸序列分别为seqid no.22和seq id no.23。

30、再一方面，本发明提供了包括前述的核苷酸序列的表达载体。

31、所述的表达载体可以是质粒、噬菌体、病毒。

32、又一方面，本发明提供了表达前述的抗人cd34抗体或核苷酸序列或表达载体的细胞。

33、所述的细胞的作用在于可以高效表达抗人cd34抗体。

34、具体地，所述的细胞可以是hek293或cho。

35、又一方面，本发明提供了制备前述的抗人cd34抗体的方法，所述的方法中包括培养前述的细胞。

36、所述的方法中还可能包括抗体纯化步骤。

37、所述的抗体纯化步骤可以是沉淀法、广谱亲和纯化、抗原特异性纯化、离子交换法。

38、又一方面，本发明提供了对前述的抗人cd34抗体进行荧光标记的方法，所述的方法中包括使用大分子染料或小分子染料对抗人cd34抗体进行标记。

39、优选地，所述的大分子染料为pe和/或fitc。

40、又一方面，本发明提供了前述的抗人cd34抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在cd34检测中的应用，所述的应用为非疾病诊断或治疗的应用。

41、所述的应用为通过抗体抗原结合实现。

42、所述的应用可以是检测t淋巴细胞中的cd34。

43、又一方面，本发明提供了前述的抗人cd34抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞在制备cd34检测试剂盒中的应用。

44、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于cd34检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

45、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

46、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料或小分子染料。

47、优选地，所述的大分子染料为pe和/或fitc。

48、又一方面，本发明提供了一种cd34检测方法，所述的检测方法通过前述的抗人cd34抗体进行检测。

49、具体地，所述的检测方法中还可以包括样品前处理步骤。

50、所述的前处理步骤为样本的采集及处理。

51、优选地，所述的检测方法非疾病诊断或治疗方法。

52、又一方面，本发明提供了一种cd34检测试剂盒，所述的试剂盒中包括前述的抗人cd34抗体或核苷酸序列或表达载体或细胞。

53、具体地，所述的试剂盒中还包括其他用于cd34检测的试剂，如：缓冲液、样品处理剂。

54、具体地，所述的试剂盒中还可以包括用于荧光标记抗体的分子。

55、进一步具体地，所述的分子可以是大分子染料或小分子染料。

56、优选地，所述的大分子染料为pe和/或fitc。

57、又一方面，本发明提供了前述的抗人cd34抗体在干细胞移植、骨髓移植、和/或肿瘤治疗中的应用。

58、本发明的有益效果：

59、本发明提供了一种新的抗人cd34抗体，与cd34具有较好的结合能力和特异性，能够用于制备表达抗人cd34抗体的细胞，从而实现大量制备，为cd34的检测提供了更便利的条件。