一种细胞色素P450氧化酶及其基因工程菌株和应用的制作方法

本发明属于基因工程、酶工程和生物，具体涉及一种来源于新金色分枝杆菌的细胞色素p450氧化酶及其基因工程菌株和它们在甾体化合物的生物转化中的应用。

背景技术：

1、甾体类药物是全球仅次于抗生素的第二大类药物，其生理活性多种多样，在现实生活中应用十分广泛。全球每年对甾体类药物有巨大的需求量，对甾体类药物合成的研究可以产生巨大的经济效益。早年，甾体类药物的合成多采用化学方法，其工艺复杂、成本高、产量低且污染大；近年来，大多以廉价易得的植物甾醇为底物，采用反应专一且高效、成本低、反应条件温和、污染小的微生物转化法获得所需的甾体类药物。

2、甾体的羟基化对于临床应用非常重要，因为这种特殊的修饰增强了甾体药物的生物活性。最早在工业生产中应用的羟化反应是利用黑根霉将黄体酮转化生成11α-羟基衍生物。从那时起，微生物羟基化反应在甾体类药物的工业生产中便广泛使用，早期工业上通过微生物进行的甾体羟化反应大部分是由真菌的生长细胞或静息细胞完成的，目前发现不仅真菌可以使甾体发生羟基化反应，微生物的羟化反应还可以在细菌中进行，例如分枝杆菌、简单节杆菌、大肠杆菌等，并且这些原核生物在甾体药物合成领域具有更广泛的应用价值。

3、细胞色素p450氧化酶对甾体的微生物转化可视为微生物对外源性甾体化合物的解毒过程。细胞色素p450氧化酶代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单加氧酶类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名，其可在体内催化多种反应且主要为单加氧反应。细胞色素p450氧化酶的主要作用是催化非活性基团r-h的羟基化反应。它们是一种含有亚铁血红素(heme)的单加氧酶，普遍存在于动物、高等植物、藻类、真菌和细菌中。

4、在可以完全代谢植物甾醇或胆固醇的菌种，如新金色分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、诺卡氏菌和红球菌中，除了cyp125、cyp124、cyp142外，还存在多个细胞色素p450氧化酶基因，但对它们在甾体代谢中的作用还了解甚少。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明通过基因克隆表达方法，获得了具有甾体16-羟基化活性的p450酶及其基因，并将它们用于新型甾体中间体的制备。

2、具体地，本发明提供了一种来自新金色分枝杆菌的p450氧化酶及其氨基酸序列和核苷酸序列，以及包含所述p450氧化酶的基因的表达菌株。利用该表达菌株可有效地转化植物甾醇、胆固醇，或雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄二烯二酮(add)、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮或睾酮(ts，testosterone)等。

3、经过在cytochrome p450 homepage(http://drnelson.uthsc.edu/cytochromep450.html)中进行比对，发现该p450氧化酶属于cyp105家族，故命名该蛋白为cyp105x-1，其编码基因为cyp105x-1。该酶及其基因的获得为细菌p450氧化酶对甾体物质的16位羟基化奠定了理论和实践基础。

4、一方面，本发明提供了一种具有甾体化合物16位羟基化活性的细胞色素p450氧化酶，其氨基酸序列：

5、(1)如seq id no.1所示；

6、(2)为由seq id no.1所示氨基酸序列经过1、2、3、4或更多个氨基酸的缺失、取代或添加而得的氨基酸序列；或

7、(3)为与seq id no.1所示氨基酸序列具有73.60％以上的同源性的氨基酸序列。

8、根据本发明的一些实施方式，所述甾体化合物可以选自植物甾醇、胆固醇、雄甾-4-烯-3,17-二酮(ad)、雄二烯二酮(add)、9-羟基雄烯二酮(9-ohad)、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮和睾酮(ts)中的一种或多种。

9、根据本发明的一些实施方式，所述73.60％以上的同源性可以为73.60％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。

10、根据本发明的一些实施方式，所述与seq id no.1所示氨基酸序列具有73.60％以上的同源性的氨基酸序列可以如seq id no.3或5所示。

11、另一方面，本发明提供了一种编码根据本发明的细胞色素p450氧化酶的基因。

12、根据本发明的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列可以为编码根据本发明的细胞色素p450氧化酶的氨基酸序列的核苷酸序列或包含编码根据本发明的细胞色素p450氧化酶的部分氨基酸序列的核苷酸序列。

13、根据本发明的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列可以为编码氨基酸序列如seq id no.1、3或5所示的细胞色素p450氧化酶的核苷酸序列。

14、根据本发明的一些实施方式，所述基因的核苷酸序列：

15、(1)如seq id no.2、4或6所示；

16、(2)与seq id no.2、4或6所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或

17、(3)与seq id no:2所示核苷酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同源性的核苷酸序列。

18、优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

19、再一方面，本发明提供了一种基因工程菌株，其为包含或表达编码根据本发明的细胞色素p450氧化酶或根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因菌株。

20、本发明对于引入根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因的宿主菌株没有特殊限制，其包括但不限于源自链霉菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、棒杆菌属、节杆菌属、红球菌属、分枝杆菌菌属、大肠杆菌菌属或酵母菌属的菌株等。

21、优选地，所述基因工程菌株为表达根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因的分枝杆菌。

22、优选地，根据本发明的基因工程菌株通过其获得的甾体化合物16位羟基化活性能够以高效率产生16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物。

23、优选地，所述基因工程菌株的基因组中引入根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因。进一步优选地，所述基因工程菌株基因组中通过表达质粒或基因组插入引入根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因。更优选地，所述基因工程菌株过表达根据本发明的细胞色素p450氧化酶基因。

24、优选地，所述基因工程菌株为保藏号为cgmcc no.25582的新金分枝杆菌(btad-16a)。

25、再一方面，本发明还提供了根据本发明的细胞色素p450氧化酶或根据本发明的基因工程菌在制备16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物中的用途。

26、根据本发明的一些实施方式，所述16位酮基甾体化合物可以为16-氧代睾酮(16-oxo-ts)。

27、根据本发明的一些实施方式，所述16位羟基甾体化合物可以为16-β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(16βoh-ad)和/或16-α-羟基睾酮(16αoh-ts)。

28、再一方面，本发明还提供了一种16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物的制备方法，其包括采用根据本发明的细胞色素p450氧化酶催化甾体化合物转化为16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物，或者采用根据本发明的基因工程菌转化甾体化合物为16位酮基甾体化合物和/或16位羟基甾体化合物。

29、根据本发明的一些实施方式，所述甾体化合物可以选自植物甾醇、胆固醇、雄甾-4-烯-3,17-二酮、雄二烯二酮、9-羟基雄烯二酮、雄酮、雄诺龙、去氢表雄酮、宝丹酮和睾酮中的一种或多种。

30、根据本发明的一些实施方式，所述16位酮基甾体化合物可以为16-氧代睾酮。

31、根据本发明的一些实施方式，所述16位羟基甾体化合物可以为16-β-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮和/或16-α-羟基睾酮。

32、根据本发明的一些实施方式，所述制备方法可以包括以下步骤：

33、(1)将根据本发明的基因工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，得到种子培养物；

34、(2)将步骤(1)得到的种子培养物接种到含有甾体化合物的发酵培养基中进行培养，得到发酵液；

35、(3)对步骤(2)得到的发酵液进行分离纯化。

36、优选地，在步骤(1)中，所述种子培养包括将根据本发明的基因工程菌接种于种子培养基中进行一级种子培养，然后转接于种子培养基中进行二级种子培养。

37、优选地，在步骤(1)中，所述种子培养基包含：牛肉膏0.1-0.5g/l，蛋白胨0.5-2.0g/l，酵母粉0.1-0.5g/l，甘油1.0-3.0g/l，调节ph至6.5-7.5。

38、优选地，在步骤(1)中，所述种子培养为震荡培养；更优选地，所述震荡培养在以下条件下进行：温度为30-35℃，转速为200-250转/分，时间为2-5天。

39、优选地，在步骤(2)中，所述发酵培养基包含：大豆蛋白胨1-5g/l，酵母提取物0.5-2g/l，葡萄糖0.5-2g/l，柠檬酸0.1-0.3g/l，柠檬酸铁铵0.01-0.05g/l，k2hpo4 0.5-1.5g/l，mgso4·7h2o 0.01-0.1g/l，nh4no3 0.1-0.5g/l，调节ph至6.5-7.5。

40、优选地，在步骤(2)中，所述含有甾体化合物的发酵培养基包含0.05-2g/l甾体化合物。

41、优选地，在步骤(2)中，所述培养为震荡培养；更优选地，所述震荡培养在以下条件下进行：温度为30-35℃，转速为200-250转/分，时间为7-12天。

42、优选地，步骤(3)中，所述分离纯化包括以下步骤：将步骤(2)得到的发酵液采用乙酸乙酯萃取，并将萃取液旋干。

43、本发明获得了一种能够对甾体类物质，如ad、add、9-ohad或ts的16位进行羟基化的新金色分枝杆菌p450氧化酶，该酶可对甾体类物质进行16β羟基化，在分枝杆菌中最终将其异构化为16-oxo-ts，其在分枝杆菌缺氧的还原性条件下被进一步还原为16αoh-ts。本发明还利用基因重组技术获得了表达本发明获得的p450基因的菌株，可将ad转化为16-oxo-ts，该物质的生物活性也可进一步研究，同时16-oxo-ts也可以在还原性条件下转变为16αoh-ts。

44、与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

45、本发明提供的p450表达菌株高效地生产16-oxo-ts和16αoh-ts，纯度最高可达到90％以上。因此，本发明可明显降低甾体类药物的生产原料成本和能耗，提高药物前体的利用率，可大幅度简化ad等甾体类药物的制备工艺，得到高纯度和产率的ad等系列衍生产品。本发明还揭示了该p450基因在分枝杆菌代谢甾醇过程中的作用，该基因功能的阐释为代谢工程与合成生物学在甾体转化过程中的应用奠定了新的基础。