一种稳定性提升的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种稳定性提升的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。

背景技术：

1、β-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.21)属于糖苷水解酶类，由liebig和wohler于19世纪30年代在苦杏仁中首次发现，它可水解末端、非还原性的烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-d-糖苷键，同时释放葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷酶对多种底物都有活性，在生物燃料生产、食品加工、制药等行业中起到非常重要的作用。

2、食品中许多生物活性化合物以糖苷形式存在，当被β-葡萄糖苷酶水解时，释放出可被人类吸收的具有生物活性的苷元，这对健康有额外的好处。大豆作为蛋白质含量最高的粮食作物，所含有的异黄酮因其健康特性而被认为是重要的食品补充剂，主要以大豆苷、染料木苷等糖苷形式存在。这些不活跃的糖苷经β-葡萄糖苷酶转化为大豆苷元和染料木素以发挥积极的作用。稳定性好的β-葡萄糖苷酶具有潜在的应用价值。

技术实现思路

1、本发明提供了一种稳定性提升的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。本发明以海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶经过半理性改造的突变体为基础，通过计算机辅助设计，获得突变基因。将含有突变后的重组质粒经大肠杆菌诱导表达后，获得了稳定性提升的β-葡萄糖苷酶。以pnpg为底物时，测得突变体的稳定性提高了4.3倍。在异黄酮转化实验中，在反应体系中加入0.75u的突变酶可将1.6mg的异黄酮水解90％以上，保证水解率相同的情况下，相同反应条件下加入相同酶量的出发酶，转化的底物量是突变酶的一半。该突变体在异黄酮的水解中具有潜在的应用价值。

2、本发明β-葡萄糖苷酶突变体，其氨基酸序列如seq id no:1所示，第360位的丝氨酸突变为赖氨酸。

3、本发明β-葡萄糖苷酶突变体，其氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。

4、本发明β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明突变质粒，含有如seq id no:2所述的β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因。

6、本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的菌株，含有所述突变质粒。

7、本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的工程菌株，其分类命名为escherichia colibl21(de3)/pet22b(+)bgl3a:s360k，已送至中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：m 20232148，保藏时间为2023年11月8日，保藏地址：中国·武汉·武汉大学。

8、本发明表达β-葡萄糖苷酶突变体的工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

9、首先以来自多粘芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)的β-葡萄糖苷酶结构为模板，利用swiss-model对β-葡萄糖苷酶bgl3a的结构进行同源建模。采用计算机辅助设计的策略，选择三种能量计算函数进行计算，两两求交集的方式获得正向筛选的突变位点，然后以共进化分析和序列保守性分析进行负筛确定突变的目标氨基酸。

10、根据β-葡萄糖苷酶bgl3a的基因序列，设计并合成突变引物，以含有β-葡萄糖苷酶bgl3a基因的重组质粒为模板，以上述的合成突变引物为引物，基于重叠延伸pcr的方法进行定点突变，获得稳定性提升的β-葡萄糖苷酶的突变基因。

11、将突变基因与peasy-t3质粒连接并转化大肠杆菌trans1-t1感受态细胞，挑取阳性克隆，对突变基因进行dna序列测定。挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有突变β-葡萄糖苷酶基因的peasy-t3重组质粒，用nde i和xho i双酶切peasy-t3重组质粒和表达质粒载体，然后用t4dna连接酶连接酶切后的突变基因与表达质粒载体，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明突变基因的工程菌株。

12、上述构建方法中所述表达质粒载体包括pcold、pet15、pet22或pet28等。

13、上述构建方法中所述宿主菌包括e.coli bl21(de3)、e.coli dh5α、e.coli jm109或e.coli rosetta等。

14、本发明β-葡萄糖苷酶突变体可由所述工程菌株发酵获得。

15、本发明β-葡萄糖苷酶突变体的应用，是以所述β-葡萄糖苷酶突变体水解异黄酮。以pnpg为底物时，测得突变体的稳定性提高到出发酶的4.3倍。

16、进一步地，水解温度为30-35℃，体系ph值7.0-7.5。

17、在异黄酮水解实验中，在反应体系中加入0.75u的突变酶可将1.6mg的异黄酮水解90％以上。保证水解率相同的情况下，相同反应条件下加入相同酶量的出发酶，转化的底物量是突变酶的一半，该突变体在异黄酮的水解具有潜在的应用价值。

18、本发明对突变体蛋白和原始出发酶蛋白的最适ph、最适温度、稳定性等进行了测定和比较。突变体的稳定性得到了提升，在30-35℃、ph7.0-7.5条件下，突变体的半衰期提高到出发酶bgl3a的4.3倍，且突变并未引起最适温度和最适ph的变化。

技术特征：

1.一种稳定性提升的β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如seqidno:2所示。

3.表达权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的工程菌株，其特征在于：

4.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体在水解异黄酮中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种稳定性提升的β‑葡萄糖苷酶突变体及其应用。本发明以来自海洋未培养微生物来源的β‑葡萄糖苷酶为基础，采用计算机辅助设计，明晰突变位点，在大肠杆菌异源表达，获得了稳定性提升的β‑葡萄糖苷酶。30‑45℃条件下，突变酶的稳定性较出发酶提高到原来的4.3倍。在相同酶量条件下，突变酶转化的底物量是出发酶的两倍。该突变体在异黄酮的水解中具有潜在的应用价值。

技术研发人员：张学成,洪登望,房伟,张寅良,肖亚中
受保护的技术使用者：安徽大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12