一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用。

背景技术：

1、蛋白酶是一种能够通过切割肽键实现蛋白质及肽链降解的水解酶，其发现及使用历史悠久，是全球用量最大的酶制剂之一。蛋白酶广泛分布于自然界中，几乎所有生物体内都有蛋白酶的存在。蛋白酶参与生物体内各种生理代谢过程，其在食物消化、溶血消炎、调节血压、细胞自溶及机体衰老调控方面发挥着重要作用。

2、目前主要根据蛋白酶最适作用ph将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶三类。碱性蛋白酶的活性中心一般为丝氨酸，所以又称碱性丝氨酸蛋白酶。工业上应用较多的碱性蛋白酶主要来自于芽孢杆菌。碱性蛋白酶被广泛应用于洗涤、食品、纺织、制革等多个领域。在洗涤行业，碱性蛋白酶可用作洗涤用品的添加剂用于水解污渍中的蛋白质，能够起到降低清洗温度、减少漂洗次数，减少含磷化合物用量的作用；在食品行业，通过碱性蛋白酶水解的动植物蛋白用途广泛，可用于生产婴儿食品配料、功能性食物和饮品、及其他具有高营养价值的水解蛋白质食品；在纺织行业，碱性蛋白酶可用于熟丝的制备；在制革行业，碱性蛋白酶在皮革脱毛和软化工序中发挥着越来越重要的作用。

3、在实际工业应用中，对碱性蛋白酶往往也会提出更高的要求使其能够适应不同的使用场景，目前现有的碱性蛋白酶的酶活和热稳定性往往达不到上述要求，因此开发一种耐高温碱性蛋白酶具有重要意义。

4、公开号为cn116904428a的专利中公开了：一种改良高温碱性蛋白酶aprthc的稳定性的方法及突变体，对碱性蛋白酶aprthc进行l362i、k211g和/或r173g突变，以提升其热稳定性和ph稳定性，对于提升蛋白酶的综合性能，降低蛋白酶的使用成本具有重要意义，为蛋白酶的性质改良提供了有效的技术方法。但其在ph稳定性方面，相对于突变前提升有限。

5、公开号为cn 110777136 a的专利中公开了：一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为枯草芽孢杆菌pb92的蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体至少包含以下氨基酸的置换：v262i。使其能更好的适用于工业领域，特别是洗涤剂行业。使碱性蛋白酶在碱性ph条件下以及耐热性方面的酶活有所提高，为其更好的适应工业化生产奠定了基础。但其耐热性能的提升有限。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种碱性蛋白酶突变体，它具有耐高温，较宽的ph稳定性等优点，相对于突变前性能更优。

2、具体地，本发明提供了一种耐高温碱性蛋白酶，即所述的碱性蛋白酶突变体。本发明中对其编号为耐高温碱性蛋白酶aplm，其由seq id no.1所示的氨基酸序列突变得到，突变位点包括s101p、g131a、k170r中的任一或多。

3、如本领域技术人员一般理解，所述的氨基酸取代的含义分别是第101位丝氨酸突变体为脯氨酸、第131位甘氨酸突变为丙氨酸、第170位赖氨酸突变为精氨酸。

4、本发明的突变前序列seq id no.1为来自地衣芽孢杆菌（ bacillus  licheniformis）的碱性蛋白酶apl，该酶基因编码275个氨基酸，理论分子量为27.5 kda。

5、具体地，突变后的氨基酸序列（耐高温碱性蛋白酶aplm）如seq id no.2所示。

6、seq id no. 1：

7、maqtvpygiplikadkvqaqgfkganvkvavldtgiqashpdlnvvggasfvageayntdgnghgthvagtvaaldnttgvlgvapsvslyavkvlnssgsgsysgivsgiewattngmdvinmslggasgstamkqavdnayargvvvvaaagnsgssgntntigypakydsviavgavdsnsnrasfssvgaelevmapgagvystyptntyatlngtsmasphvagaaalilskhpnlsasqvrnrlsstatylgssfyygkglinveaaaq；

8、seq id no.2：

9、maqtvpygiplikadkvqaqgfkganvkvavldtgiqashpdlnvvggasfvageayntdgnghgthvagtvaaldnttgvlgvapsvslyavkvlnssgpgsysgivsgiewattngmdvinmslggasastamkqavdnayargvvvvaaagnsgssgntntigyparydsviavgavdsnsnrasfssvgaelevmapgagvystyptntyatlngtsmasphvagaaalilskhpnlsasqvrnrlsstatylgssfyygkglinveaaaq。

10、本发明还提供了前述耐高温碱性蛋白酶的相关基因工程产物，选自：

11、1、表达基因（基因）

12、2、表达载体（重组载体）；

13、3、基因工程细胞（重组菌株）。

14、具体地：

15、基于前述的氨基酸序列，本发明提供编码前述的耐高温碱性蛋白酶的基因。

16、基于密码子简并性原则，在知晓氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可以设计出多种基因用于表达相应耐高温碱性蛋白酶。

17、作为优选，所述的基因可以包括如seq id no.3所示的核苷酸序列或与其具有80%以上同一性的核苷酸序列。

18、本发明通过基因合成方法合成了蛋白酶突变体基因 aplm，dna全序列分析结果表明，蛋白酶aplm基因 aplm全长828bp。

19、seq id no.3：

20、atggcgcaaactgtaccatacggtattccactcataaaagccgataaggtgcaggcacaaggatttaaaggggccaatgttaaggttgcagtacttgacacgggtatccaggcaagtcatccggacctcaatgtcgtgggcggggcttctttcgttgctggtgaggcatataataccgatggtaacgggcatgggacacacgtggcgggtacagtcgcggctctcgataacacgacaggggtcttaggcgttgcgcccagtgtatcactatacgcggttaaggtgttgaacagctcgggcccgggatcttattctgggattgtgagtggcatcgaatgggctactacgaacggaatggatgttataaacatgtcgttgggtggcgcctcagcatctacggctatgaagcaggcggtagacaacgcatacgcccggggagttgtcgttgtggctgcggccggcaactccgggagcagcgggaatacaaatacaattggataccctgcgaggtatgattcggtgatcgctgtaggagccgttgattctaattcgaacagggcgagtttctcgtcagtcggcgccgaactggaggtaatggcacccggagcgggcgtatattccacttaccctaccaatacgtatgcaaccctgaacggtacctcgatggcatccccacacgtcgctggcgctgctgctttgattttatccaaacatccgaacctttctgccagtcaggtgcgtaatagactgagctccactgctacctatttaggttcttcattttattacgggaaaggtctaataaatgtagaggcagctgcacaatga。

21、本发明所述的重组载体用于表达前述的耐高温碱性蛋白酶，或者表述为包括前述的基因。

22、所述的重组载体的载体骨架可以由本领域技术人员根据实施需要进行选择，可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的载体，包括但不限于真核载体和原核载体。优选为 ppic9k-aplm，将本发明的蛋白酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的蛋白酶基因插入到质粒 ppic9k上的 ecori和 noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 ppic9k- aplm。

23、本发明所述的基因工程细胞用于表达前述的耐高温碱性蛋白酶，或者表述为包括前述的基因或重组载体。

24、所述的基因工程细胞的基础细胞可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的细胞类型，包括但不限于真核细胞或原核细胞。

25、根据实施需要，所述的基因工程细胞本领域技术人员可以选择为重组菌株。所述重组菌株的基础菌株可以是大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌；优选为为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，进一步优选为毕赤酵母细胞( pichia pastoris)gs115。

26、在一些实施例中，所述的重组菌株优选为重组菌株 gs115/ aplm，其含义为表达 aplm基因的毕赤酵母 gs115菌株。

27、基于前述的基因工程产物，本发明提供了前述的耐高温碱性蛋白酶的制备方法。

28、根据本领域技术人员一般理解，所述的制备方法中可以包括通过基因工程进行表达。通常可以包括以下步骤：

29、1)构建表达前述的耐高温碱性蛋白酶的重组载体，转化宿主细胞，得重组菌株；

30、2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶表达；

31、3)回收并纯化得耐高温碱性蛋白酶aplm。

32、优选地，将所述的重组载体为重组酵母表达质粒，所述的宿主细胞（重组菌株的基础菌株）为毕赤酵母细胞( pichia pastoris)gs115，得到重组菌株 gs115/ aplm。

33、本发明还前述的耐高温碱性蛋白酶在蛋白质及肽链降解中的应用。

34、具体地，可以用于洗涤、食品制备或制革。

35、相应地，本发明保护包括前述的耐高温碱性蛋白酶的酶制剂。

36、本发明的有益效果：

37、本发明的蛋白酶突变体aplm具有良好的热稳定性，并在常温下具有较宽的ph稳定性。本发明的蛋白酶突变体，其最适ph值为10.5，在ph8.0-11.5范围内具有较高的催化活性（剩余酶活>60%）；最适温度为60℃，在20℃仍具有30%左右的酶活力；75℃处理后仍有80%活力。

38、本发明首先解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在洗涤、食品、制革等行业中应用的耐高温碱性蛋白酶。本发明的耐高温碱性蛋白酶所具备的特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本耐高温碱性蛋白酶可应用于洗涤行业，加速对蛋白污渍如牛奶、血液、肉汁等的水解作用，从而节省洗涤时间和洗涤用水量，提高清洗效率，另一方面，加酶洗涤剂的使用改良了传统洗涤剂配方，减少了磷等对环境有害的化学物质以及漂白剂等的添加量，不仅可以保护人体免受洗涤剂的伤害，还可以增加环保效益。在食品行业的应用上，耐高温碱性蛋白酶还可应用与奶酪的制作、肉类的软化、面包发酵以及生物活性肽的制备等，不仅可以改善食品的风味，还能够提高营养价值，降低视频的杂菌污染从而延长食品的保质期。此外，在制革行业的应用上，耐高温碱性蛋白酶在脱毛时可有效地分解角蛋白和弹性蛋白，从而提升皮革质量；软化过程可以提高皮革的延展性和韧性，应用潜力巨大。