一种脐血间充质干细胞来源外泌体的提取与纯化方法

本发明涉及外泌体提取，特别涉及一种脐血间充质干细胞来源外泌体的提取与纯化方法。

背景技术：

1、外泌体，作为细胞间通信的重要载体，包含丰富的生物信息，如蛋白质、脂质和rna等。它们在生物医学研究中显示出巨大的潜力，尤其是在疾病诊断、治疗和再生医学领域。外泌体的尺寸和成分直接关联到其生物学功能和临床应用价值。因此，从各种生物样品中高效提取和纯化特定尺寸和成分的外泌体，已成为现代生物医学研究的重要课题。特别是脐血间充质干细胞来源的外泌体(cb-mscs exosomes)，由于其独特的源和潜在的治疗价值，对其高效的提取与纯化技术有着迫切的需求。

2、目前，外泌体的提取和纯化主要依赖于离心、超滤和免疫亲和纯化等方法。尽管这些方法在一定程度上能够分离外泌体，但仍存在诸多限制。例如，离心法虽然普遍应用，但往往无法充分区分外泌体与其他微小颗粒，如微囊泡，导致纯化效果受限。免疫亲和纯化法提供了一种相对特异的分离方式，但成本高昂且操作复杂。此外，这些传统方法往往无法有效控制外泌体的尺寸分布，限制了外泌体在精准医疗和疾病诊断中的应用。因此，现有技术虽在外泌体提取方面取得了进展，但在纯化效率、成本、操作复杂度以及尺寸选择性方面仍存在显著的不足。

3、鉴于现有技术的局限性，本发明旨在开发一种更为高效、特异且成本效益较高的方法，以提取和纯化脐血间充质干细胞来源外泌体。特别地，本发明通过使用温度敏感性凝胶电泳结合改进的离心和洗脱步骤，旨在实现更精准的尺寸选择性分离，并显著提高外泌体的纯化效率。此外，本方法还注重维持外泌体的生物活性和完整性，以适应后续的生物医学研究和临床应用需求。通过这种创新的方法，本发明将有效克服现有技术的不足，为外泌体的临床研究和应用提供一个更为可靠和有效的技术平台。

技术实现思路

1、为了实现上述发明目的，针对上述技术问题，

2、本发明提供一种脐血间充质干细胞来源外泌体的提取与纯化方法，该方法包括以下步骤：

3、s1)收集脐血间充质干细胞来源外泌培养液；

4、s2)使用缓冲液处理所述培养液得到溶液a，进行初步分离得到溶液b；

5、s3)使用温度敏感性凝胶进行电泳实现外泌体的进一步纯化；

6、s4)对所提取的外泌体进行后续的提取和纯化处理。

7、优选的，步骤s2)中所述缓冲液包括去离子水、mes(2-(n-吗啉乙基)琥珀酸)作为ph调节剂、nacl、牛血清白蛋白、triton x-100(壬基酚聚氧乙烯醚)、甘油、dmso(二甲基亚砜)以及tris(三羟甲基氨基甲烷)。

8、优选的，去离子水作为基础；

9、将ph调节至7.0-7.4；

10、加入nacl直至9g/l；

11、加入0.5-2％w/v牛血清白蛋白和0.05-0.2％ triton x-100v/v；

12、加入甘油至最终浓度为5-10％v/v；

13、加入dmso至最终浓度为0.1-1％v/v；

14、加入tris至最终浓度为10-50mm。

15、优选的，将所述溶液a转移到离心管中，在3000g的条件下离心10-15分钟，收集上清液得到溶液b。

16、优选的，步骤s3)中所述温度敏感性凝胶由聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)和0.1-0.5％w/w的n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)制备的凝胶。

17、优选的，所述n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)添加量为聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)的0.1-0.5％w/w。

18、优选的，步骤s3)中所述温度敏感性凝胶的制备步骤为：

19、在容器中加入pnipam；

20、慢慢加入去离子水，不断搅拌直至pnipam完全溶解；

21、向pnipam溶液中加入bis，均匀搅拌；

22、将混合溶液在60℃的水浴中加热，维持ph值在7.0；加热12小时形成凝胶。

23、优选的，步骤s3)中所述电泳操作步骤：

24、将制备好的温度敏感性凝胶置于电泳槽中，电源设定在100v，初始温度设定为4℃，并在电泳过程中逐渐将温度升高至30-40℃，升温速率为5-10℃/小时；制备0.5％(w/v)溴酚蓝；

25、取多组溶液b分别加入凝胶的孔中，加载体积为20-30μl；

26、其中一组向溶液b中加入少量的溴酚蓝作为染色标记，最终浓度为0.05％(w/v)，得到溶液c，将溶液c加载到凝胶的孔中；

27、电泳结束后，从凝胶中切除含有外泌体的部分，并使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)将外泌体从凝胶片段中洗脱出来。

28、优选的，步骤s4)中使用100,000g-120,000g超高速离心进一步纯化外泌体。

29、缓冲液中的各组分如mes、nacl、牛血清白蛋白、triton x-100、甘油、dmso和tris共同作用于培养液，提供适宜的ph值和离子强度，保护外泌体结构，并帮助分离外泌体与其他细胞成分。特别是牛血清白蛋白和triton x-100，有助于稳定外泌体并减少非特异性的蛋白质吸附。通过在处理过程中使用上述缓冲液，确保了外泌体在进入温度敏感性凝胶电泳之前已经处于较为理想的状态。缓冲液中的成分帮助保护外泌体，减少了可能影响电泳效率和准确性的因素。

30、利用聚n-异丙基丙烯酰胺(pnipam)和n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(bis)制备的温度敏感性凝胶，在不同温度下改变其物理性质。在较低温度下，凝胶孔隙较大，允许外泌体进入；升高温度使凝胶孔隙缩小，从而更精确地分离特定大小的外泌体。

31、缓冲液的选择和离心步骤直接影响外泌体的初步提取效率和纯度，确保在后续步骤中处理的是相对纯净的外泌体样本。

32、温度敏感性凝胶的使用为尺寸选择性分离提供了关键机制。通过控制电泳过程中的温度，可以针对性地分离特定大小范围的外泌体，从而提高外泌体样品的纯度和特异性。

33、本发明的关键技术，包括缓冲液的配制、离心步骤和温度敏感性凝胶电泳，共同构成了一个内部协同和相互关联的系统，有效解决了提取和纯化外泌体时面临的挑战。缓冲液不仅提供了适宜的环境以保护外泌体，还通过离心步骤初步分离外泌体。随后，温度敏感性凝胶电泳进一步纯化外泌体，并实现尺寸选择性分离。这一系列步骤的综合作用，确保了从脐血间充质干细胞培养液中高效、准确地提取和纯化外泌体，为生物医学研究和临床应用提供了可靠的技术支持。

34、本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果：

35、通过精心设计的缓冲液和离心步骤，本发明显著提高了从脐血间充质干细胞培养液中提取外泌体的效率。这种高效率提取方法减少了样品处理时间，同时增加了外泌体收集的数量，为进一步的生物医学研究提供了丰富的样品资源。增强外泌体纯度：

36、利用温度敏感性凝胶电泳和超高速离心步骤，本发明在提取过程中显著减少了来自原始生物样品的细胞碎片和蛋白质污染。这一点对于确保外泌体样品的高纯度至关重要，特别是在后续用于精确疾病诊断或治疗研究时。

37、本发明通过使用温度敏感性凝胶的独特特性，实现了对外泌体的尺寸选择性分离。这不仅提高了纯化的准确性，还允许针对特定尺寸范围的外泌体进行研究，这对于理解不同尺寸外泌体的生物学功能和临床应用极为重要。

38、通过精确控制温度条件，本发明确保了在整个提取和纯化过程中对外泌体尺寸分布的精确控制。这种优化的提纯效率和精确性使得外泌体样品更适合用于生物标志物分析和其他精准医学应用。