细胞治疗产品中复制型逆转录病毒RCR-GALV的检测组合物、方法及试剂盒与流程

本发明涉及分子生物检测领域，特别涉及一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测组合物、方法及试剂盒。

背景技术：

1、逆转录病毒(retrovirus)，又称反转录病毒，属于rna病毒中的一类，它们的遗传信息不是储存在脱氧核糖核酸(dna)，而是储存在核糖核酸(rna)上。逆转录病毒基因组为二倍体，两条相同的单股正链rna，其两端为长末端重复序列(ltr)，内含有较强启动子和增强子，对病毒dna的转录调控具有重要作用。病毒核心包含逆转录酶和整合酶。与其他rna病毒不同之处在于，逆转录病毒的rna不进行自我复制，进入宿主细胞后，rna经逆转录酶合成双链dna，双链dna被整合酶整合至宿主细胞染色体dna上形成前病毒，建立终生感染并可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。

2、目前应用于细胞治疗的逆转录病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体，缺陷型病毒载体的基因组rna缺少逆转录病毒复制所需的gag、pol和env序列，理论上大大降低了产生复制型病毒的风险，但是在逆转录病毒载体的生产过程中这些包装元件是必不可少的，因此就有同源重组产生可复制性逆转录病毒的可能性。因为复制型逆转录病毒(rcr)存在的潜在致病性，所以更需要严格的检测以排除基于逆转录病毒载体的人类细胞治疗产品中rcr的存在。

3、对于逆转录病毒中的长臂猿白血病病毒(galv)的滴度确定，常规方法是用空斑法测定，空斑法的目的是测定病毒空斑形成单位(pfu，plaque forming unit)，用于病毒滴度测定及标定病毒的感染能力。空斑法的操作相对复杂，对实验员的要求也更高，因此实验结果的稳定性会相对较差。

4、复制型逆转录病毒(rcr)检测：根据目前的研究技术水平，一般采用敏感的指示细胞培养法对γ-逆转录病毒载体进行rcr检测。rcr扩增细胞与待测样本进行共培养以最大程度扩增rcr，在一定传代次数和时间的传代培养后取适量上清接种rcr指示细胞培养，以观察、计数细胞病变集落或者进行rcr标志物的检测，常规方法仅依靠细胞病变效应判断结果，会存在假阳的可能性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测组合物，该检测组合物具有高灵敏度、高特异性的优点。

2、本发明还提供了一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测试剂盒，利用本试剂盒能够准确、快速的检测样品中galv的含量。目前所用的γ-逆转录病毒载体很多都是人工改造的逆转录病毒载体，一般在检测时依据所选用的包膜基因来确定对应的阳性对照病毒，因此本发明中所提的阳性对照病毒均为galv。

3、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

4、一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测组合物，所述检测组合物包括如下检测galv的引物和探针：

5、forwardprimer：agcagcagctgttttactggggttggga，seq id no：1，

6、reverse primer：gcgctgactgagtcttggagggc，seq id no：2，探针：5’-fam-tcgccatagatgctgacctccg-bhq1-3’，seq id no：3，

7、一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测试剂盒，该试剂盒包含本发明所述的检测组合物。

8、作为优选，该试剂盒还包含：galv阳性对照病毒；galv敏感细胞，如hek293细胞；galv阳性rna参考品。

9、作为优选，该试剂盒主要由试剂a和试剂b组成：

10、试剂a为qpcr反应预混液，包括探针法qpcr专用试剂2×one step rt-pcr bufferⅲ，takara ex taq hs(5u/μl)，primescript rt enzyme mixⅱ，rox reference dye内参染料，无核酶水，所述的检测galv的引物和探针；

11、试剂b为阳性对照，包含galv阳性rna参考品，浓度为2e9 copies/μl。

12、一种细胞治疗产品中复制型逆转录病毒rcr-galv的检测方法，该方法包括以下步骤：

13、s1、待测样品的扩增及指示培养，提取待测样品的rna；

14、s2、采用本发明所述的检测组合物建立荧光定量pcr反应体系；

15、s3、进行荧光定量pcr检测；

16、s4、待测样品的结果分析及判断。

17、作为优选，荧光定量pcr反应体系为20μl，包含15μl的试剂a和5μl的模板；所述模板为待测样品的rna、阳性对照参考品或阴性对照参考品。

18、作为优选，所述反应体系的反应条件为：42℃反转录5m，95℃预变性3m；95℃变性5s，55℃退火34s，5个循环；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环。

19、作为优选，s4中检测结果同时满足以下条件，判定检测结果有效：

20、阴性对照组没有cpe，且galv qpcr检测结果为未检出；

21、阳性对照组有cpe，且galv qpcr检测结果ct值＜35。

22、作为优选，s4中，结果判断标准是：

23、若待测样品的检测结果为未检出且没有cpe，则判定该批次样品未检出复制型逆转录病毒galv；

24、若待测样品有ct值，且ct值＜35且有明显cpe，则判定该批次样品中检出复制型逆转录病毒galv。

25、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

26、1、本发明所述的galv滴度测定方法选用了tcid50法，tcid50法是通过计算能够引起50％细胞病变或死亡(cytopathic effect，cpe)所需的病毒量来反映病毒滴度，而pfu法是通过计算病毒在单层细胞上形成的空斑数量来反映病毒滴度。一个tcid50代表一个具有感染能力的病毒颗粒(infectious viral particle)，一个空斑也代表一个具有感染能力的病毒颗粒，因此tcid50与感染性滴度成正比，pfu也与感染性滴度成正比；

27、相比于tcid50法，空斑法不能用于检测不能使单层细胞形成空斑的病毒。同时，空斑法在操作的过程中需要覆盖一层半固体的琼脂层，可能影响病毒与细胞的吸附与感染。tcid50法的检测限比空斑法高，即tcid50法能够检测到更低浓度的病毒。这是因为tcid50法是基于概率统计学的方法，而空斑法是基于计数的方法。tcid50法只需要在一定比例的细胞中观察到cpe就可以计算出tcid50，而空斑法则需要在单层细胞上形成可见的空斑才可以计算出pfu；

28、2、本发明所述的长臂猿白血病病毒galv的检测组合物，其中探针5’端选用fam荧光报告基团，3’端选用bhq1荧光淬灭基团；

29、其中引物探针设计的靶点位于env上，因此可以特异性的检出所感染的病毒是否是galv病毒；

30、3、本发明所述的长臂猿白血病病毒galv的检测试剂盒，含有用于检测galv的阳性对照病毒试剂，通过将受检样品与hek293细胞共同培养的方式进行扩增，再在pg-4细胞上指示培养后细提取rna作为样品，并进行荧光定量pcr检测以确定galv是否检出，检测限为1tcid50 galv；

31、本发明所述的长臂猿白血病病毒galv的检测方法在hek293细胞上培养21天，期间传代次数不少于5次，然后对培养物进行三冻三融后再在pg-4细胞上指示培养7天，能够有最大程度扩增出其中可能存在的rcr，同时通过收集细胞裂解物上清，传代至pg-4细胞上，通过观察细胞病变cpe来初步判断，并进一步通过实时荧光定量pcr检测，进而提高该检测方法的灵敏度，并特异性地检出galv。