含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体及制备方法和应用

本发明涉及的是一种含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、一氧化氮(no)是由no聚合酶内源性的合成，广泛存在于哺乳动物组织和细胞中，它在心血管系统、中枢神经系统以及免疫系统中都不可或缺。然而，任何事物都具有两面性，过量的no会产生毒副作用，从而导致细胞死亡。因此no的精准释放和量的控制对于实现其医学、药理作用非常重要。no供体是一类能在体内释放出no的前体药物是指不需经nos催化自行或与其它物质作用产生no的物质。鉴于其潜在的应用价值，越来越多的no供体被开发和应用于各种相关疾病的治疗。然而传统的作为no供体的药物在使用时存在很多缺陷如：缺乏靶向性和组织特异性、药物作用时间过短、生理稳定性差、对人体毒副作用大、有效剂量难以掌握和控制等。近年来，一系列致力于解决上述难题的新型no供体被开发和研制出来，增加了no应用于临床治疗中的广泛性和可行性，因此一氧化氮供体化合物的合成成为了近年来的研究热点。

2、no供体被开发并广泛应用于生物学研究和临床治疗。当今，no供体的研究趋势主要集中在新型no供体的合成、传统no供体新的应用途径的开发、no供体/药物结合物的开发以及组织特异性no供体的研发4个方面。在这4个研究领域中，由于no在体内分布的广泛性，设计合成具有组织特异性no供体是最具挑战性的工作。由于no具有多种生理功能，开发单一调节某种生理功能的no供体显得十分困难。然而近年来人们已经开始对这方面的问题有所了解并提出了一些解决方案，例如将no供体与组织特异性配体(尤其是单克隆抗体)结合起来，可增加药物的靶向性；在皮腔内冠状动脉血管成形术中，这种药物可直接到达并作用于患病部位，同时避免了各种副作用的发生。

3、no供体是一种在生物体内经过简易酶解或其他作用后释放出no的化合物，它在储存、运输no的同时能有效地克服它寿命短、半衰期短等缺点，其能够自发地或是在施加合适的刺激(即温度、ph、光)时从特定的分子和大分子支架中释放no。其中，光照是一种无创调控no释放的手段，具有时空控制和照射波长/强度可调等优点。近期文献报道了一些光触发一氧化氮供体，但光触发一氧化氮供体仍然存在很多不足，例如对一氧化氮释放位置，释放速率控制效果不佳。高发病率的糖尿病及血管并发症涉及一系列与氧化应激和no功能缺失相关的危险因素。溶酶体α-葡萄糖苷酶是一种存在于肠道刷状缘膜结合酶，糖尿病病人α-葡萄糖苷酶水解低聚糖释放葡萄糖，最终导致餐后高血糖。血糖水平升高导致糖基化加速，从而产生晚期糖基化终产物(ages)；ages引起的蛋白质结构和功能的改变被认为是糖尿病与严重并发症之间的主要联系。通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性减缓葡萄糖在肠道吸收达到降低血糖的目的，是治疗糖尿病最简单的方法之一。长期高血糖是糖尿病的特点，它会产生过量的活性氧ros，如超氧负离子、h2o2、onoo-、no等。inos产生的高浓度no与ros反应生成活性氮rns，no与超氧负离子反应生成onoo-，与onoo-生成no2。氧化应激是ros产生增加和抗氧化系统减少的结果，只有当抗氧化防御系统不能抵消过量ros时，氧化应激才会引起损伤。氧化应激的激活产生了一系列有害的代谢过程，如多元醇活性增加、增加ages的形成，蛋白激酶c激活等。此外，临床和实验观察表明，氧化应激是糖尿病及并发症发生的主要机制。普遍认为，在餐后阶段，血糖升高和氧化应激可能会加速ages的形成。因此，高血糖和ages都被认为是糖尿病并发症的主要病理原因。通过一氧化氮光计量能够对一氧化氮的释放动力学、释放总量以及释放速率有清晰的了解,这对揭示一氧化氮和生物反应之间的相关性有重大意义。

4、同时母体单元中含有香豆素结构又具有着一定的优势，天然香豆素及其衍生物已被实验证明具有抗糖尿病活性，对α-葡萄糖苷酶具有一定抑制能力。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是香豆素衍生物的主要靶向酶，其抑制作用可治疗高血糖。高剂量的香豆素可能会产生毒性，如致癌性和肝毒性。在现有的香豆素衍生物分子中引入一个亚硝基，在光照的条件下释放no抑制α-葡萄糖苷酶，再通过香豆素结构协同作用改善生物活性降低毒副作用，从而获得具有潜在药用价值的化合物。

技术实现思路

1、针对现有技术中光控一氧化氮供体较少,且释放位置和释放速率控制效果不佳的问题,本发明目的在于提供一种抗干扰能力强的酶促光控一氧化氮供体及其制备方法和应用。

2、本发明的另一目的在于提供上述一氧化氮供体的制备方法,原料易得,合成步骤简单,产率高。

3、本发明的再一目的在于提供式ⅰ化合物在制备治疗或预防糖尿病、高血压相关疾病和心血管疾病的药物或相关的用途。

4、为实现上述目的,本发明采用如下技术方案。

5、一种含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体，其具有下式所示结构：其中r1为h、c1-10链烷基、c1-10环烷基、c1-4烷氧基、苯基、苄基；r2为烷氧基，苯基，对甲苯基，间甲苯基，邻甲苯基，邻硝基苯基，苯氧基，乙酰氧基，苯氟基。

6、所述含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体，其具有下式所示结构：

7、所述含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体，其具有下式所示结构：

8、所述含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体，其具有下式所示结构：

9、所述含香豆素骨架的酶促光控一氧化氮供体，其具有下式所示结构：

10、

11、所述一氧化氮供体的制备方法，包括以下步骤：(1)将化合物1a溶于有机溶剂中，加入碘甲烷参与反应，加入碳酸钾作为催化剂，加热搅拌反应液，反应结束后用dcm萃取有机相，分液，干燥，减压蒸发溶剂得到粗品，粗产品经柱层析分离纯化得到化合物2a。

12、

13、(2)将化合物2a溶于有机溶剂中，再加入亚硝酸叔丁酯，加热搅拌。反应结束后减压蒸发溶剂得到粗品，粗品经硅胶柱层析得到所需的一氧化氮供体ⅰ

14、

15、所述一氧化氮供体的制备方法，包括以下步骤：(3)将化合物1a溶于有机溶剂中，加入二碳酸二叔丁酯参与反应，加入无机碱作为催化剂，加热搅拌过夜。再用冰水淬灭反应，并用ea萃取分液，干燥。减压蒸发溶剂得到粗品，经过柱层析分离纯化得到化合物3a；

16、

17、(4)将化合物3a溶于有机溶剂中，搅拌反应液，再加入亚硝酸叔丁酯，加热搅拌。反应结束后减压蒸发溶剂得到粗品，粗品经硅胶柱层析得到所需的一氧化氮供体ⅱ

18、

19、所述一氧化氮供体的制备方法，包括以下步骤：(5)将化合物1a溶于有机溶剂中，加入三氟甲磺酸酐参与反应，加入无机碱作为催化剂，将整个反应体系降温搅拌。反应结束后，向反应体系中加入冰水淬灭反应，用dcm萃取有机相，分液。减压蒸发溶剂，得到粗品，经过柱层析分离纯化得到化合物4a

20、

21、      

22、(6)将化合物4a溶于有机溶剂中，加入3,4,5-三氟苯硼酸参与反应，加入四三苯基膦钯，碳酸钾作为催化剂，加热搅拌。反应结束后用dcm萃取有机相，分液。减压蒸发溶剂得到粗品，经过柱层析分离纯化得到化合物5a

23、

24、(7)将化合物5a溶于有机溶剂中，搅拌反应液，再加入亚硝酸叔丁酯，加热搅拌。反应结束后减压蒸发溶剂得到粗品，粗品经硅胶柱层析得到所需的一氧化氮供体ⅲ

25、

26、所述一氧化氮供体的制备方法，包括以下步骤：(8)将化合物4a溶于有机溶剂中，加入对甲氧基苯硼酸参与反应，加入四三苯基膦钯，碳酸钾作为催化剂，加热搅拌；反应结束后用dcm萃取有机相，分液；减压蒸发溶剂得到粗品，经过柱层析分离纯化得到化合物6a

27、

28、(9)将化合物6a溶于有机溶剂中，搅拌反应液，再加入亚硝酸叔丁酯，加热搅拌。反应结束后减压蒸发溶剂得到粗品，粗品经硅胶柱层析得到所需的一氧化氮供体ⅳ

29、

30、任一所述一氧化氮供体在制备治疗或预防糖尿病、高血压相关疾病和心血管疾病的药物中的用途。

31、步骤(1)中，所述反应的有机溶剂为thf

32、步骤(1)中，所述反应加热温度为50～60℃

33、步骤(1)中，所述反应时间为12～24小时

34、步骤(1)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(10-5)

35、步骤(2)中，所述反应的有机溶剂为dcm

36、步骤(2)中，所述反应加热温度为30～40℃

37、步骤(2)中，所述反应时间为3～4小时

38、步骤(2)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(6-4)

39、步骤(3)中，所述反应的有机溶剂为dcm

40、步骤(3)中，所述反应温度为30～40℃

41、步骤(3)中，所述反应的无机碱为碳酸钾

42、步骤(3)中，所述反应时间为12～24小时

43、步骤(3)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(10-8)步骤(4)中，所述反应的有机溶剂为dcm

44、步骤(4)中，所述反应加热温度为30～40℃

45、步骤(4)中，所述反应时间为3～4小时

46、步骤(4)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(10-7)步骤(5)中，所述反应的有机溶剂为dcm

47、步骤(5)中，所述反应温度为0℃至室温

48、步骤(5)中，所述反应的无机碱为碳酸钾

49、步骤(5)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(7-5)步骤(6)中，所述反应的有机溶剂为dmf；

50、步骤(6)中，所述反应加热温度为100～110℃；

51、步骤(6)中，所述反应时间为8～12小时；

52、步骤(6)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(8-5)步骤(7)中，所述反应的有机溶剂为dcm；

53、步骤(7)中，所述反应加热温度为30～40℃；

54、步骤(7)中，所述反应时间为3～4小时；

55、步骤(7)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(6-5)步骤(8)中，所述反应的有机溶剂为dmf；

56、步骤(8)中，所述反应加热温度为100～110℃

57、步骤(8)中，所述反应时间为8～12小时

58、步骤(8)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(7-5)步骤(9)中，所述反应的有机溶剂为dcm

59、步骤(9)中，所述反应加热温度为30～40℃

60、步骤(9)中，所述反应时间为3～4小时

61、步骤(9)中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：ea/pe＝1：(8-6)

62、为了解决在无光条件下no释放缓慢的问题，通过向合成的一氧化氮供体中添加微量的l-半胱氨酸，溶于pbs缓冲液中，可以促进一氧化氮供体在黑暗条件下释放no

63、本发明酶促一氧化氮供体释放一氧化氮的机理如下：

64、带有亚硝基的一氧化氮供体ⅰ，在pbs缓冲液中，由于l-半胱氨酸具有还原性，可以促进具有氧化性的一氧化氮供体释放一氧化氮，同时l-半胱氨酸是生物体内大量含有的生物酶，可以在生物体大量共存。此时在添加了l-半胱氨酸的条件下，即使无光照条件一氧化氮释放量也可提升50％～60％。