一种富含n-3脂肪酸裂壶藻藻株及其筛选、培养的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种富含n-3脂肪酸裂壶藻藻株及其筛选、培养。

背景技术：

1、n-3脂肪酸是一类多元不饱和脂肪酸，主要包括二十碳五烯酸(c20:5,cis-5,8,11,14,17，epa)，二十二碳五烯酸(c22:5,cis-7,10,13,16,19，n-3dpa)以及二十二碳六烯酸(c22:6,cis-4,7,10,13,16,19，dha)等，存在于深海海洋动物以及海洋微生物中。n-3脂肪酸是人类必需的营养活性物质，对人体的神经发育和慢性疾病的预防有着重要的作用。传统n-3脂肪酸的来源是从鱼油中获取，但由于海洋资源日益枯竭、频繁出现海洋污染等多方面原因，高质量鱼油的供应已经大幅度的下降。海洋微藻作为n-3脂肪酸的最初生产者，其发酵过程安全可控、无需占用土地资源，是可替代鱼油的绿色可持续性发展来源。

2、裂殖壶菌是目前商业生产中最重要的产油微藻之一，多以生产dha为主，其产量可达40g/l。此外，裂壶藻也能同时生产epa和n-3dpa等不饱和脂肪酸，但野生型菌株合成epa和n-3dpa的能力有限、无法满足产业化生产所需。因此，探究裂壶藻同时高含量n-3脂肪酸一直是相关学者研究的热点。大量研究表明，裂壶藻生产脂肪酸的途径主要分为脂肪酸合成酶途径和酮聚合酶途径。其中脂肪酸合成酶途径是大都微生物都具备的，主要涉及脂肪酸前体物质的一系列脱水、缩合、延长等步骤。脂肪酸合成首先利用乙酰辅酶a和丙二酰辅酶a反应合成棕榈酸(c16:00)，棕榈酸再通过延长酶和去饱和酶的催化下合成亚油酸(c18:2n-6),之后在δ15、δ6去饱和酶的催化下分别进入n-6途径和n-3途径。其中n-3途径最终可合成epa、n-3dpa、dha等不饱和脂肪酸。酮聚合酶途径主要涉及脂肪酸酰基中间体的脱水和异构化反应，有研究表明，酮聚合酶途径除了可直接合成dha，也能合成dpa和epa，但具体合成途径和机制依旧存在争议。

3、因此，寻找理想的菌种诱变、菌种驯化和基因工程等手段方法，增强裂壶藻脂肪酸合成酶的n-3途径以提高epa和n-3dpa的含量具有较大需求。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供诱变裂壶藻菌的培养基和筛选裂壶藻菌的培养基，通过合适的诱变方法和筛选方法，获得了一株裂壶藻菌，该菌株中epa和dpa与原始菌株相比，大大提高，该菌种遗传稳定性好，生长速度快，具有良好的产业化前景。

2、具体的，一方面，本发明提供了一株裂壶藻菌，名称为裂壶藻hs08；保藏信息：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.40902。

3、另一方面，本发明提供了一种诱变裂壶藻菌的诱变培养基，所述诱变培养基含有诱变剂，所述诱变剂选自亚硝基呱、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯中的一种或多种；所述诱变剂的浓度是0.1％-5.0％；

4、在一些实施例中，所述诱变剂为0.5～2％甲基磺酸乙酯或0.5～2％硫酸二乙酯；优选地，所述诱变剂为1％甲基磺酸乙酯或1％硫酸二乙酯。

5、在一些实施例中，所述诱变培养基还含有葡萄糖40～60g/l、酵母浸粉9～15g/l、无水硫酸钠15～20g/l、氯化钾0.5～1g/l、七水硫酸镁3～5g/l、硫酸钾0.25-～0.9g/l、磷酸二氢钾0.5～3.5g/l、硫酸铵0.5～3.5g/l和无水氯化钙0.1～2g/l，ph值自然；

6、在一些实施例中，所述诱变培养基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉10g/l、无水硫酸钠15g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁4.1g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、硫酸铵1.0g/l、无水氯化钙0.17g/l。

7、另一方面，本发明提供了一种筛选裂壶藻菌的筛选培养基，所述筛选培养基含有筛选剂，所述筛选剂选自精喹禾灵、浅蓝菌素、vb12、二苯胺中的一种或多种；浅蓝菌素的浓度为0.001～1mm，精喹禾灵的浓度为0.001～1mm、二苯胺的浓度为0.001～1mm，vb12的浓度为1～100ug/l。

8、在一些实施例中，精喹禾灵的浓度为0.01～0.08mm；浅蓝菌素的浓度为0.01～0.02mm；vb12的浓度为0.01ug/l。

9、在一些实施例中，所述筛选培养基还含有葡萄糖40-60g/l、酵母浸粉9～15g/l、无水硫酸钠15～20g/l、氯化钾0.5～1g/l、七水硫酸镁3～5g/l、硫酸钾0.25～0.9g/l、磷酸二氢钾0.5～3.5g/l、硫酸铵0.5～3.5g/l、无水氯化钙0.1～2g/l、琼脂粉5～20g/l，ph值自然。

10、在一些实施例中，所述筛选培养基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉12g/l、无水硫酸钠15g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁4.1g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、硫酸铵1.0g/l、无水氯化钙0.17g/l、琼脂粉10g/l。

11、另一方面，本发明提供了一种裂壶藻菌筛选方法，包括步骤：

12、(1)将裂壶藻菌种接种至种子培养基中培养24h，得到裂壶藻种子液；

13、(2)吸取种子液，离心弃去上清液用ph＝8.0的磷酸缓冲液清洗并重悬得到种子悬液；将种子悬液接种至本发明所述的诱变培养基中培养，获得突变裂壶藻液；

14、(3)吸取突变裂壶藻液，用ph＝8.0的磷酸缓冲液稀释至一定梯度，然后吸取稀释的突变裂壶藻液涂布于本发明所述的筛选培养基上培养；

15、(4)挑选出生长速度快，边缘规整的单一菌落涂布于本发明所述的筛选培养基中培养；

16、(5)将挑出生长速度快，大小适中的菌落转接至种子培养基中，培养24h后保种，得到拟纯化高产裂壶藻菌菌株。

17、(2)中，ph＝8.0的磷酸缓冲液清洗并重悬是ph＝8.0的磷酸缓冲液清洗并ph＝8.0的磷酸缓冲液重悬。

18、在一些实施例中，裂壶藻菌种为hs01裂壶藻种，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.13746。

19、在一些实施例中，所述种子培养基包括葡萄糖40～60g/l、酵母浸粉9～15g/l、无水硫酸钠15～20g/l、氯化钾0.5～1g/l、七水硫酸镁3～5g/l、硫酸钾0.25～0.9g/l、磷酸二氢钾0.5～3.5g/l、硫酸铵0.5～3.5g/l和无水氯化钙0.1～2g/l，ph值自然。

20、在一些实施例中，所述种子培养基中，葡萄糖50g/l、酵母浸粉12g/l、无水硫酸钠15g/l、氯化钾0.5g/l、七水硫酸镁4.1g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、硫酸铵1.0g/l和无水氯化钙0.17g/l。

21、在一些实施例中，步骤(2)是在28℃、180r/min培养1-6h。

22、在一些实施例中，步骤(3)是在37℃培养箱中倒置培养48h。

23、在一些实施例中，步骤(4)是在37℃培养箱中倒置培养48h。

24、在一些实施例中，步骤(5)是在28℃、180r/min摇床培养24h。

25、本发明以公司原有产多不饱和脂肪酸菌株裂壶藻hs01为出发菌株(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.13746)，该菌株dha含量可达40％以上，但epa含量和n-3dpa含量仅0.5％左右，拟通过诱变筛选方法，获得富含epa、n-3dpa、dha的新菌株。

26、术语说明

27、现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本技术不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本技术为准。

28、应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

29、除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

30、在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

31、在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有n值的数字时，任何具有n+/-1％、n+/-2％、n+/-3％、n+/-5％、n+/-7％、n+/-8％、n+/-10％、n+/-15％或n+/-20％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减。