本发明涉及一种纳米多孔磁珠，具体地说，是一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠及其应用方法。
背景技术：
1、水蛭是我国南方广为分布的一类环节动物，也是我国传统医学中一味重要的药材，水蛭酸性多肽是水蛭及其唾液腺中提取出来的一种分子量在10k da以下的单链多肽化合物，泛称水蛭素。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂，包含三种变异体。研究表明，水蛭酸性多肽在瘀血所致的多种疑难杂症中均有很好的预防及治疗效果，副作用低，比肝素更有优越性。现代药理研究发现，水蛭酸性多肽具有抗凝血、抗血小板聚集、扩张血管及抗炎活性，还能防止肿瘤细胞的转移，其配合化疗和放疗，可促进肿瘤中的血流而增强疗效，因而具有宽阔的临床应用前景。
2、我国具有非常丰富的天然水蛭资源，重组水蛭素的制备方兴正艾，分离水蛭多肽具有较高的临床应用价值，常用多肽的分离方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。凝胶层析分离机理是分子筛效应，根据分子的大小进行分离纯化；离子交换层析是依据物质表面所带电荷量不同进行分离纯化的技术；疏水层析是利用样品分子的疏水基团与层析介质疏水配基之间的作用力不同进而分离纯化的一种方法；亲和层析是利用配基与生物大分子间的特异性可逆结合的特征进行分离纯化的技术。但这些分离方法独立应用时有自身的缺陷，比如，凝胶层析可分离出分子量相近的物质，但不能将其中电荷不同、生物活性不同的分子分离；再比如，离子交换层析可以分离带同种电荷的分子，但样品基质尤其是动物药提取液中大量干扰蛋白与目标分子电荷相同，无法分离。另外以上四种常用的层析方法还存在处理过程繁复，耗时长，自动化程度不高的局限。
3、磁性多孔材料，因其较好的稳定性、快速分离能力、表面功能基易修饰、孔径可调等特质，在环境、医药、催化和能源等领域得到广泛的应用。磁性多孔材料的设计可基于孔隙结构设计也可基于功能设计，制备的方法主要有模板法、溶胶凝胶法和电化学法，基于磁性多孔微纳材料的磁性固相萃取技术，可将上述多种层析方法的优势结合，不仅可以排除大量生物大分子的干扰，还可以将电性相同、疏水能力相近的分子快速提取，且对样品活性几乎无损坏。将其用于水蛭酸性多肽的分离，具有良好前景。
4、磁性多孔材料的结构可分为三部分：1)核心部分是磁性物质，如γ-fe2 o3和fe3o4；2)中间层由惰性硅基层包裹，保证磁纳米粒子的密封性良好，不易出现漏磁现象，另聚合上功能基团，实现对酸性多肽的选择性吸附；3)外层由琼脂糖多孔层包覆，达到分子排阻的功效。
5、针对目的物质的结构制备合适的磁珠，是达到高效分离和富集的关键，也是难点。一般来说，制备磁性多孔材料过程需要关注磁性大小、孔径大小、孔内活性基团的选择、基团密度等等多个方面。水蛭酸性多肽分子量在10k da以下，结构中包含疏水区域，易溶于水，在水溶液中带负电。根据其结构特征，磁性多孔材料的功能设计上可以选用两亲性单体(亲水/疏水性)与阳离子单体共聚策略，孔径设计上可调节外层琼脂糖的交联度，将分子量大于10k da的大分子排除孔外，实现水蛭酸性多肽的高选择性分离。
技术实现思路
1、发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠及其应用方法。
2、技术方案：本发明所述一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，所述的纳米多孔磁珠按如下方法制备：
3、s1、将十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，磁性纳米粒子fe3o4分别溶解或分散，然后在三口烧瓶中混合，向烧瓶中加入氨水，氮气保护下搅拌均匀，向体系中滴加正硅酸四乙酯(teos)、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(mps)及无水乙醇的混合溶液。滴加完全后搅拌、升温，反应过夜，得到mps修饰的硅基磁珠；
4、s2、量取s1得到的mps磁珠分散于乙腈然后转入烧瓶，机械搅拌。分别加入二乙烯苯(dvb)，n-乙烯基吡咯烷酮(nvp)，阳离子单体和偶氮二异丁腈(aibn)，在氮气保护下搅拌均匀，冷凝回流3h，得到双亲性阳离子聚合物包覆的磁珠；
5、s3、量取s2得到的阳离子共聚物磁珠分散在水中，另称取琼脂糖，加入水后放入微波炉中加热至沸腾，将完全溶解的琼脂糖水溶液与磁珠分散液混合并搅拌，降温至30℃后继续搅拌0.5h，清洗所得磁珠，重新分散于水中，加入环氧氯丙烷，搅拌均匀，再加入提前溶好的氢氧化钠水溶液，在45℃下保持搅拌，反应2h。反应结束加入tris碱，升温至100℃，反应1h，得到多孔琼脂糖包覆的阳离子共聚物磁珠。
6、作为优选的，s1中，所述的氨水的用量以所述的fe3o4的质量计为0.2～0.5ml/g。
7、作为优选的，s1中，所述的teos，mps和无水乙醇的体积比例为2:7:9，3:8:10和5:9:10中的一种。
8、作为优选的，s2中，所述阳离子单体包括苄乙基三甲基氯化铵(vbtac)和1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑(amimcl)，所述dvb，nvp，阳离子单体的质量比例为6:3:4，5:3:2和4:3:1中的一种。
9、作为优选的，s3中，所述琼脂糖的用量以所述的阳离子共聚物磁珠的质量计为0.01～0.05ml/g。
10、作为优选的，s3中，所述环氧氯丙烷的用量以所述的阳离子共聚物磁珠的质量计为5～10ml/g。
11、一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠的应用方法，包括以下步骤：
12、s1、取制备的纳米多孔磁珠与水蛭酸性多肽接触；
13、s2、纳米多孔磁珠与水蛭酸性多肽充分接触后再将纳米多孔磁珠与溶液分离；
14、s3、用洗脱剂脱下附纳米多孔磁珠上的水蛭酸性多肽。
15、作为优选的，s3中，所述洗脱剂包括0.1％～1％甲酸和0.1％～1％三氟乙酸中的一种。
16、本发明相比于现有技术具有以下有益效果：本发明的纳米多孔磁珠，通过在磁性硅基表面修饰阳离子基团，对酸性多肽具有选择性吸附，外层交联琼脂糖，将大分子蛋白排除孔外，吸附水蛭酸性多肽的回收率高，效率高，可重复利用度高，应用前景良好。
1.一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：所述的纳米多孔磁珠按如下方法制备：
2.根据权利要求1所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：s1中，所述的氨水的用量以所述的fe3o4的质量计为0.2～0.5ml/g。
3.根据权利要求1所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：s1中，所述的teos，mps和无水乙醇的体积比例为2:7:9，3:8:10和5:9:10中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：s2中，所述阳离子单体包括苄乙基三甲基氯化铵(vbtac)和1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑(amimcl)，所述dvb，nvp，阳离子单体的质量比例为6:3:4，5:3:2和4:3:1中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：s3中，所述琼脂糖的用量以所述的阳离子共聚物磁珠的质量计为0.01～0.05ml/g。
6.根据权利要求1所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠，其特征在于：s3中，所述环氧氯丙烷的用量以所述的阳离子共聚物磁珠的质量计为5～10ml/g。
7.如权利要求1～7中任意一项所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠的应用方法，其特征在于：包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种用于提取水蛭酸性多肽的纳米多孔磁珠的应用方法，其特征在于：s3中，所述洗脱剂包括0.1％～1％甲酸和0.1％～1％三氟乙酸中的一种。