一种复合酶及其应用的制作方法

本发明涉及合成生物学，具体涉及一种复合酶及其应用。

背景技术：

1、本发明所涉及的技术领域中，目前的技术现状是通过小片段核酸(dna，rna或者类似物)的化学合成形成前体核酸(前体rna)，再通过酶学合成的办法拼接成更长的核酸(rna)。存在的技术问题是可以选择的酶比如t4 rna连接酶的连接活性不高，最高也只能够达到50％左右的连接效率，这会导致整体生产原料成本过高。因此，急需一种具有高效率的rna连接酶。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种复合酶及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供一种复合酶，所述复合酶包括：

4、(1)双链rna连接酶；

5、(2)具有底物亲和性的蛋白，所述蛋白选自dna双链结合结构域、rna/dna复合链结合结构域、单链dna共价结合蛋白、或者dsrna结合蛋白中的一种或多种；

6、一个或多个所述具有底物亲和性的蛋白通过第一融合蛋白接头(linker)连接在双链rna连接酶n端和/或c端；

7、所述底物为第一单链rna片段、第二单链rna片段和夹板寡核苷酸(adaptor)；

8、所述第一单链rna片段包含含有羟基基团的3'末端区域；

9、所述第二单链rna片段包含含有磷酸基团的5'末端区域；

10、所述夹板寡核苷酸为单链dna和/或单链rna寡核苷酸，且所述夹板寡核苷酸(adaptor)包括第一部分和第二部分，所述第一部分与第二单链rna片段的5’端末端序列互补，所述第二部分与第一单链rna片段的3’端末端序列互补；所述第一部分从夹板寡核苷酸的序列5’端起始，占夹板寡核苷酸总长度的30％～70％(例如35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％)。

11、本发明的复合酶可以将第一单链rna片段和第二单链rna片段连接形成长度中等的rna。

12、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述双链rna连接酶为t4 rna连接酶2(t4rl2)，其为由如seq id no:8所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有t4 rna连接酶2活性的蛋白质。

13、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述夹板寡核苷酸(adaptor)由第一部分和第二部分组成，所述第一部分从夹板寡核苷酸的序列5’端起始，占夹板寡核苷酸总长度的40％～60％。

14、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，多个相同或不同的具有底物亲和性的蛋白通过第二融合蛋白接头连接后再通过第一融合蛋白接头接在双链rna连接酶n端和/或c端。

15、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述第一融合蛋白接头或所述第二融合蛋白接头为多个重复的ggggs氨基酸序列；优选地，第一融合蛋白接头或所述第二融合蛋白接头为3～4个重复的ggggs氨基酸序列。

16、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述夹板寡核苷酸的长度为20～100个(例如30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个)核苷酸。

17、本发明中的夹板寡核苷酸一方面可以通过序列配对将第一单链rna片段(p1)和第二单链rna片段(p2)形成一个可以被双链rna酶连接的底物形式。另一方面可以通过结构域的共价或者非共价结合让双链rna酶在空间上与第一单链rna片段(p1)和第二单链rna片段(p2)接近，进一步提高了双链rna酶的连接效率。

18、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述第一和第二单链rna片段的长度分别为40～70个(例如45个、50个、55个、60个、65个)核苷酸。

19、本发明中，具有底物亲和性的蛋白与底物的结合的方式，与所述蛋白自身的功能有关。其中，rna/dna复合链结合结构域可以直接与由第一或第二单链rna分子和单链dna寡核苷酸(夹板寡核苷酸)形成的rna/dna复合链相结合；单链dna共价结合蛋白halotag可以与单链dna寡核苷酸(夹板寡核苷酸)通过共价键连接；dna双链结合结构域是通过夹板dna寡核苷酸上形成的一个额外的dna双链(额外的dna 双链可以是单链dna夹板寡核苷酸中间位置或3’端或5’端额外增加的一段完全互补的核苷酸序列，或者是单链dna夹板寡核苷酸的3’端或5’端额外延伸的茎-环结构)与夹板寡核苷酸结合的，进而将t4rl2拉到需要连接的接口位置；dsrna结合蛋白可以与由第一或第二单链rna分子与单链rna寡核苷酸(夹板寡核苷酸)形成的rna双链相结合。

20、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述dna双链结合结构域包括：sso7d、nf-κb p50、hbd中的一种或多种。

21、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述rna/dna复合链结合结构域包括单克隆抗体s9.6的scfv、rnaseh1(d210n)、hbd、sso7d中的一种或多种。

22、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述单链dna共价结合蛋白为halotag。

23、本发明中，所述rnaseh1(d210n)是氨基酸序列第210位采用天冬氨酸(d)替换天冬酰胺(n)的核糖核酸酶h1，即催化活性失活的核糖核酸酶h1；所述halotag来源可以是商品型质粒pfn19a中的halotag。

24、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述dsrna结合蛋白(drbp)包括pkr、trbp、pact、staufen、nfar1、nfar2、spnr、rha、nrebp、kanadaptin、hyl1 hyponasticleaves、adar1、adar2、adar3、tenr、rnaseiii、dicer、rde-4中的一种或多种。

25、本领域已知的dsrna结合蛋白都适用于本发明，例如文献saunders l r,barber gn.the dsrnabinding protein family:critical roles,diverse cellular functions[j].the faseb journal,2003,17(9)中表1中列出的dsrna结合蛋白。

26、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述sso7d为由如seq id no:9所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:9所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有dna双链结合结构域活性的蛋白质；

27、优选地，所述hbd为由如seq id no:10所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:10所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有rna/dna复合链结合活性的蛋白质；

28、优选地，所述nf-κb p50为由如seq id no:11所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:11所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有dna双链结合结构域活性的蛋白质；

29、优选地，所述halotag为由如seq id no:12所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:12所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有单链dna共价结合活性的蛋白质；

30、优选地，所述rnaseh1(d210n)为由如seq id no:14所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:14所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有rna/dna复合链结合活性的蛋白质；

31、优选地，所述单克隆抗体s9.6的scfv为由如seq id no:13所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者如seq id no:13所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有rna/dna复合链结合活性的蛋白质。

32、在上述复合酶中，作为一种优选实施方式，所述复合酶的核苷酸序列为seq idno:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、或seq id no:7。

33、第二方面，本发明提供一种基于上述复合酶的酶法合成rna的方法，所述方法包括方法a、方法b或方法c：

34、所述方法a依次包括以下步骤：

35、s1、将第一单链rna片段、第二单链rna片段和单链dna夹板寡核苷酸加入酶连缓冲液中，得到混合溶液；

36、s2、将复合酶加入所述混合溶液中，进行酶连反应；

37、所述方法b依次包括以下步骤：

38、sa、将单链dna夹板寡核苷酸与复合酶混合，制备得到单链dna-蛋白复合体；

39、sb、将第一单链rna片段、第二单链rna片段、以及所述单链dna-蛋白复合体加入酶连缓冲液中，进行酶连反应。

40、所述方法c依次包括以下步骤：

41、si、第一单链rna片段、第二单链rna片段和单链rna夹板寡核苷酸加入酶连缓冲液中，得到混合溶液；

42、sii、将复合酶加入所述混合溶液中，进行酶连反应。

43、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a中的复合酶的具有底物亲和性的蛋白为dna双链结合结构域、rna/dna复合链结合结构域中的一种或多种。当具有底物亲和性的蛋白为dna双链结合结构域时，所述单链dna夹板寡核苷酸为带有额外双链dna的单链dna夹板寡核苷酸。

44、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法b中的复合酶的具有底物亲和性的蛋白为单链dna共价结合蛋白。

45、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法c中的复合酶的具有底物亲和性的蛋白为dsrna结合蛋白。

46、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a的步骤s1和/或方法c的步骤si中，还包括对所述混合溶液进行热变性处理，热变性处理后自然冷却或者梯度降温至20℃～30℃(例如21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃)，所述变性处理的温度为94～96℃(例如94.5℃、95℃、95.5℃)，变性处理的时间为3～5分钟(例如3.5分钟、4分钟、4.5分钟)；优选地，所述梯度降温为以0.05～0.2℃/s(例如0.075℃/s、0.1℃/s、0.125℃/s、0.15℃/s、0.175℃/s)的速率降温至20～30℃。

47、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a和方法c中，所述酶连反应的体系中第一单链rna片段、第二单链rna片段，和夹板寡核苷酸的终浓度均为10～30μm。

48、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a和方法c中，所述酶连反应的体系中上述复合酶的终浓度为1nm～10μm(例如10nm、50nm、100nm、500nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm)。

49、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法b中，所述酶连反应的体系中第一单链rna片段、第二单链rna片段的终浓度均为10～30μm(例如15μm、20μm、25μm)，单链dna-蛋白复合体的终浓度为10～30μm(例如15μm、20μm、25μm)。

50、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a、方法b和方法c中，所述酶连缓冲液的ph为7.5，所述酶连缓冲液包括终浓度为0.1～50mm(例如1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm)的dtt，终浓度为10～1000μm(例如50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm)的atp，和终浓度为10～500mm(例如50mm、100mm、200mm、300mm、400mm)的tris-hcl。

51、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a、方法b和方法c中，所述酶连反应的温度为36～38℃(例如36.5℃、37℃、37.5℃)。

52、在上述酶法合成rna的方法中，作为一种优选实施方式，方法a、方法b和方法c中，所述酶连反应的时间为10～720min(例如50min、100min、150min、200min、300min、400min、500min、600min、700min)。

53、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

54、和现有商业化的t4 rna连接酶2相比，工程改造后的t4 rna连接酶可以提高连接效率到80-90％，甚至更高，远远高于野生型的t4 rna连接酶2。