油菜BnaREM1.3基因及其编码蛋白在调控作物抗旱性中的应用

本发明属于植物基因工程，涉及一种bnarem1.3基因及其编码蛋白在调控油菜抗旱性中的应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napus，aacc，2n＝38，以下简称油菜)是我国第一大油料作物，菜籽油产量占油料作物的47％以上，是最重要的食用植物油来源之一。我国油菜种植面积约为1.1亿亩，其中长江流域冬油菜约为1亿亩，北方春油菜约为0.1亿亩。油菜主产区容易受到季节性干旱或持续性干旱的影响，严重威胁油菜生长发育和产量。2022年，我国平均气温偏高，长江流域发生历史罕见夏秋冬连旱，对油菜生产造成严重损失。因此，挖掘油菜抗旱基因、解析其抗旱调控机制对油菜高产稳产具有重要意义。

2、当植物在苗期受到干旱胁迫时，其根冠比提高，地上部形态和地下部形态都会发生改变。地上部改变主要包括叶片萎蔫、叶片水势和含水量降低、地上部生物量降低、株高降低等，地下部根系的改变包括根系膨大和分支数增多等。这些改变会严重抑制植物的正常生长和发育甚至影响产量。植物抵御干旱胁迫是一个复杂的生物学过程，与多种生物学途径密切相关。目前，在模式植物拟南芥中已报道大量与抗旱相关的基因，而油菜中抗旱相关基因研究还较少。利用基因工程创制具有不同抗旱性的油菜，可以为油菜抗性育种提供重要的基因资源和种质资源。

3、remorin蛋白首次在番茄的叶片中发现，其大小约为34kd，最初被命名为pp34。后因其依靠coiled-coil结构结合于质膜的结构特点类似于吸附在其他大型海洋生物体表面的海鱼remora，将其命名为remorin。remorin(rem)是一种植物特异性膜脂纳米结构域定位蛋白，具有一个包含coiled-coil结构域的高度保守c端和一个不保守的n端，n端的多样性决定了其功能的多样性。它与抗去垢剂膜相互作用构成了脂筏的主要成分，脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，与膜的信号转导密切相关。随着对remorin蛋白研究的不断深入，在越来越多的植物中鉴定到了remorin蛋白并解析了其功能。与脂筏的功能多样性相同，remorin蛋白在植物生物进化、生长发育、抗病抗逆信号转导等方面发挥重要作用。

4、remorin蛋白具有功能多样性。首先，它参与植物的生物进化过程，研究人员在藻类植物中没有鉴定到remorin蛋白而在苔藓类和蕨类植物中鉴定到remorin蛋白，这意味着remorin蛋白的出现是随着植物适应陆地环境进化而来。remorin蛋白参与植物的生长发育，在短尾紫花苜蓿和日本莲花等豆科植物中，remorin蛋白与共生受体样蛋白激酶相互作用，这是结瘤所必需的。remorin蛋白还能诱导活性氧，上调烟草中与程序性细胞死亡有关蛋白的含量。remorin蛋白还参与了植物的抗病抗逆和信号转导过程。目前，已经发现植物remorin蛋白能够调控水稻条纹病毒、稻瘟病、番茄青枯病、早酥梨抗黑星病、马铃薯青枯病、辣椒青枯病、烟草晚疫病等在细胞间移动进而影响植物的抗病性，这是由于remorin蛋白能够作用于植物和微生物的相互作用。此外，remorin蛋白还能通过与植物激素协同调控植物的信号转导影响植物的抗逆性。水杨酸能够依赖remorin蛋白调控脂质排布进而介导胞间连丝的关闭，阻碍病毒在细胞间的移动，这也是remorin蛋白参与生物逆境调控的重要原因之一。水稻remorin蛋白也能通过与体细胞胚胎发生受体激酶结合协调脱落酸和油菜素内酯的信号传导。remorin蛋白也可以调控植物响应非生物逆境，如胡杨参与调控拟南芥镉耐受性和抗盐性等。

5、在拟南芥中，共有16个remorin蛋白。其中只有4个已经验证了功能，包括atrem1.2，atrem1.3，atrem4.1，atrem4.2，其余12个基因尚未完成验证。已验证功能的4个基因中，都集中于拟南芥的病毒防御、植物激素信号转导、种子萌发和磷酸化方面。根据remorin蛋白端序列不同可以将其分为六类：group 1，group 2，group 3，group 4，group5，group 6。其命名规则为：第一亚组(group 1)排序为第1的蛋白为atrem1.1，并以此类推。group 1组remorin蛋白根据n端脯氨酸含量高低分为group 1a(8.9％)和group 1b(14.4％)两个亚组。其中，group 1b亚组的转录本能够被低温、脱落酸处理、微生物丁香假单胞菌等多种逆境诱导表达。group 2组remorin蛋白目前只在苜蓿属和欧洲大叶杨中被鉴定到，研究表明该亚组的remorin蛋白可能与豆科植物结瘤密切相关。沉默蒺藜状苜蓿中的mtrem2.2基因能够减少根瘤的数目和生长畸形。group 3组remorin蛋白不含有n端结构域，其在植物中的研究还不清楚。group 4组remorin蛋白具有较长的n端，研究表明该组remorin蛋白能够参与植物激素间的信号转导。水稻osrem4.1蛋白能够与油菜素内酯受体结合共同协调水稻脱落酸和油菜素内酯信号的相互联系。group 5组remorin蛋白与group3组相似，研究较少，只有苜蓿属植物的remorin蛋白能够在种子中表达。group 6组remorin蛋白主要在分生组织中表达，可能参与了植物的生长发育。也有研究表明，玉米中的zmrem6.3基因能够赋予玉米对玉米叶烧病、细菌性枯萎病和常锈病的数量抗性，证明该组remorin蛋白也可能参与了植物抗病性的调控。

6、目前在油菜中，暂时没有关于remorin蛋白及其基因的家族成员分类和功能研究。在番茄中过表达油菜bnarem1.3的同源基因sirem1.3能够抑制马铃薯x病毒的移动，同样地，水杨酸也能够通过依赖于水稻osrem1.3蛋白的脂质重塑介导胞间连丝的通透性，减少病毒在植物细胞间的移动。bnarem1.3的同源蛋白atrem1.3蛋白还能够在膜微结构域促进拟南芥超敏诱导反应相关免疫复合物的形成，参与植物的免疫过程。此外，atrem1.3蛋白也能够诱导拟南芥蛋白磷酸化，调节蛋白质间的相互作用。值得注意的是，油菜bnarem1.3的同源基因atrem1.3能够在拟南芥种子萌发和抵御低温过程中诱导表达，暗示其可能参与植物生长发育和耐受性调控。

7、本发明克隆了油菜bnarem1.3基因并将其在油菜中高表达，获得的油菜苗期抗旱性显著升高。同时，利用crispr cas9技术创建bnarem1.3基因的突变体，获得的油菜苗期抗旱性显著降低。该结果表明bnarem1.3基因在调控油菜苗期抗旱性中起着重要作用，这使它在创建油菜抗旱新种质方面具有重要的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供bnarem1.3基因在培育不同抗旱性转基因植物中的应用。

2、本发明中所涉及的油菜bnarem1.3基因，编码一种remorin蛋白，在油菜a4、a5染色体上各有一个拷贝，在c04染色体上有两个拷贝。它们分别是bnaa04.rem1.3(bnaa04g26460d)、bnaa05.rem1.3(bnaa05g05140d)、bnac04.rem1.3a(bnac04g04520d)、bnac04.rem1.3b(bnac04g50490d)。其中，bnac04.rem1.3a的核苷酸序列和氨基酸序列分别如序列表seq id no:1和seq id no:2所示。其核苷酸序列长度大小为579bp，该基因编码192个氨基酸。

3、申请人通过使用农杆菌介导的遗传转化方法将bnac04.rem1.3a(bnac04g04520d)基因转入到由组成型启动子启动的过表达载体并转化到油菜的基因组中，获得油菜bnac04.rem1.3a过表达的油菜种质资源。同时利用crispr/cas9基因编辑技术获得基因bnarem1.3功能缺失的油菜种质资源。

4、接着，测定了过表达和突变体转化材料的抗旱性，发现bnarem1.3正调控油菜抗旱性。

5、本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，适用于本发明所述遗传转化的表达载体包括但不限于，如：35s-pcambia1300s、pkse401(中国农业大学陈其军课题组提供)等。

6、本发明获得的高抗旱性油菜，在其营养生长与生殖生长时期与正常植株没有明显的差异，该种质资源在油菜抗旱育种中具有十分重要的应用前景。

7、本发明获得的低抗旱性油菜，也能够被用于植物抗旱技术或相关药物研发的试验对象。