一种羊反刍胃有效成分提取物的制备方法

本发明属于羊反刍胃有效成分提取，具体涉及一种羊反刍胃有效成分提取物的制备方法。

背景技术：

1、羊的第四个胃的学名为反刍胃，是反刍动物特有的一种胃部结构。反刍动物拥有瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃四个胃，前三个胃没有胃腺，第四胃有胃腺，与普通单胃动物类似，能分泌消化液，故第四胃也称真胃。目前对于羊胃的应用主要是凝乳酶的提取，用于干酪的生产，而人们对羊胃的概念大多数仅仅停留在食用方面。《本草蒙荃》中记载：“牛羊肚健脾胃，免饮积食伤”，说明羊胃中含有对人体有益的活性成分，而羔羊第四胃中活性成分活性更高，值得被更好的利用。已有资料报道显示，羔羊第四胃内生物活性成分主要含有胃蛋白酶、凝乳酶、粘蛋白酶、蛋白及双歧因子等。羔羊胃提取物目前已应用于治疗胃病的药物原料，其中凝乳酶与胃蛋白酶结合可用于分解蛋白质促进蛋白质吸收，提高凝乳作用，改善与蛋白质溶解有关的胃功能障碍；粘蛋白可覆盖于胃黏膜表面，对胃损伤部位具有保护作用，使胃壁细胞增值，促进黏膜修复；双歧因子可促进双奇杆菌生长，对抗幽门螺旋杆菌等有害菌。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可用于分离羊反刍胃蛋白、羊反刍胃蛋白提取率高、羊反刍胃蛋白总还原能力强的羊反刍胃有效成分提取物的制备方法。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种羊反刍胃有效成分提取物的制备方法，包括：对羊反刍胃进行粗提处理制得羊反刍胃有效成分提取物粗提物，对羊反刍胃有效成分提取物粗提物进行纯化处理得到羊反刍胃有效成分提取物；纯化处理中采用琼脂糖基材料作为层析填料，琼脂糖基材料中具有砜基基团以及3-巯基丙酸异丙酯基团。本发明先通过二乙烯基砜与琼脂糖反应，再与3-巯基丙酸异丙酯反应接枝上3-巯基丙酸异丙酯基团，得到改性琼脂糖树脂，以改性琼脂糖树脂作为琼脂糖基材料应用于层析分离中，可以得到具有高还原能力的羊反刍胃蛋白，并且得到的羊反刍胃蛋白的提取率高。在对羊反刍胃进行提取时，可以得到多种蛋白，而通过本发明方法制备得到改性琼脂糖树脂，所得改性琼脂糖树脂对具有还原能力的羊反刍胃蛋白具有更高的选择分离效果。

4、优选地，有效成分提取物为羊反刍胃蛋白；或，琼脂糖基材料由二乙烯基砜分别与琼脂糖树脂和3-巯基丙酸异丙酯键合形成。

5、优选地，琼脂糖基材料的制备中，首先由琼脂糖树脂与二乙烯基砜反应制成活化琼脂糖树脂，然后由活化琼脂糖树脂与巯基试剂反应制成琼脂糖基材料。

6、更优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，将琼脂糖树脂和二乙烯基砜溶液加入碳酸盐缓冲液中，反应制备得到活化琼脂糖树脂；或，琼脂糖基材料为改性琼脂糖树脂，改性琼脂糖树脂的制备中，将活化琼脂糖树脂和3-巯基丙酸异丙酯加入hepes缓冲液中，反应制备得到改性琼脂糖树脂。

7、更进一步优选地，碳酸盐缓冲液的浓度为0.2-1m；或，碳酸盐缓冲液的ph为10-11；或，琼脂糖树脂的使用量为碳酸盐缓冲液的10-30wt%；或，二乙烯基砜溶液由二乙烯基砜和dmso混合，二乙烯基砜溶液中二乙烯基砜的含量为40-60wt%；或，二乙烯基砜的使用量为琼脂糖树脂的80-120wt%。

8、更进一步优选地，hepes缓冲液的浓度为10-30mm；或，hepes缓冲液的ph为7.5-8.5；或，活化琼脂糖树脂的使用量为hepes缓冲液的10-30wt%；或，3-巯基丙酸异丙酯的使用量为活化琼脂糖树脂的2-10wt%。

9、优选地，粗提处理包括预处理和提取处理，预处理中包括粉末化处理和脱脂脱色处理。

10、更优选地，粉末化处理中去除羊反刍胃中的脂肪及结缔组织并粉末化；或，脱脂脱色处理采用石油醚和无水乙醇处理；或，提取处理中采用氯化钠溶液提取有效成分，氯仿溶液萃取分离。

11、更优选地，纯化处理中采用氯化钠溶液洗脱。

12、优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，将琼脂糖树脂加入碳酸盐缓冲液中，然后加入二乙烯基砜溶液，在20-40℃的温度下反应6-24h，反应完成后采用乙腈洗涤除去未反应的二乙烯基砜，然后采用去离子水洗涤除去乙腈，干燥，得到活化琼脂糖树脂。

13、更优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，碳酸盐缓冲液的浓度为0.2-1m，碳酸盐缓冲液的ph为10-11。

14、更优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，琼脂糖树脂的使用量为碳酸盐缓冲液的10-30wt%。

15、更优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，二乙烯基砜溶液由二乙烯基砜和dmso混合，二乙烯基砜溶液中二乙烯基砜的含量为40-60wt%。

16、更优选地，活化琼脂糖树脂的制备中，二乙烯基砜溶液的使用量以其中二乙烯基砜的量为计量基准，二乙烯基砜的使用量为琼脂糖树脂的80-120wt%。

17、优选地，改性琼脂糖树脂的制备中，将活化琼脂糖树脂加入hepes缓冲液中，然后加入3-巯基丙酸异丙酯，在20-40℃的温度下反应3-12h，反应完成后采用去离子水洗涤，干燥，得到改性琼脂糖树脂。

18、更优选地，改性琼脂糖树脂的制备中，hepes缓冲液的浓度为10-30mm，hepes缓冲液的ph为7.5-8.5。

19、更优选地，改性琼脂糖树脂的制备中，活化琼脂糖树脂的使用量为hepes缓冲液的10-30wt%。

20、更优选地，改性琼脂糖树脂的制备中，3-巯基丙酸异丙酯的使用量为活化琼脂糖树脂的2-10wt%。

21、优选地，改性琼脂糖树脂的制备中还可以加入2-巯基咪唑，2-巯基咪唑的使用量为活化琼脂糖树脂的0.4-2wt%。本发明在使用3-巯基丙酸异丙酯对活化琼脂糖进行改性时，进一步采用2-巯基咪唑进行共同改性，提高了对高还原能力的羊反刍胃蛋白的提取率。

22、优选地，羊反刍胃蛋白的提取中，将羊反刍胃经预处理制成羊反刍胃粉末，将羊反刍胃粉末经提取处理制得羊反刍胃蛋白粗提物，对羊反刍胃蛋白粗提物进行纯化处理，得到羊反刍胃蛋白。

23、更优选地，羊反刍胃蛋白的提取中，预处理中包括粉末化处理和脱脂脱色处理，粉末化处理中，将新鲜羊反刍胃经水清洗，然后剥除脂肪及结缔组织，于零下100至零下60℃下冷冻1-5h，粉碎，冷冻干燥，得到羊反刍胃冷冻粉末；脱脂脱色处理中，将羊反刍胃冷冻粉末采用石油醚脱脂，然后再采用无水乙醇除去醇溶性小分子杂质，减压过滤，自然风干，得到羊反刍胃粉末。

24、更优选地，羊反刍胃蛋白的提取中，提取处理中，将羊反刍胃粉末加入0.5-2wt%的氯化钠溶液中制成羊反刍胃粉末的含量为2-5wt%的第一溶液，在50-65℃的温度下超声处理15-60min，然后离心分离取上清液，上清液在40-60℃的温度下浓缩至20-40%的体积，加入3-5倍体积的无水乙醇，在0-10℃的温度下静置6-24h，离心分离取沉淀，沉淀采用0.5-2wt%氯化钠溶液溶解制成羊反刍胃粉末的含量为2-5wt%的第二溶液，再加入20-40%体积的氯仿溶液充分搅拌混合，萃取分离取上层水相，透析脱盐，冷冻干燥，得到羊反刍胃蛋白粗提物，氯仿溶液由氯仿与正丁醇混合而成，氯仿溶液中氯仿与正丁醇以体积比为1：0.2-0.5的比例混合。

25、更优选地，羊反刍胃蛋白的提取中，纯化处理中，将羊反刍胃蛋白粗提物采用层析柱分离，羊反刍胃蛋白粗提物采用0.5-2wt%的氯化钠溶液配制成浓度为5-20mg/ml的羊反刍胃蛋白粗提物溶液，以0.5-2wt%的氯化钠溶液为洗脱液，洗脱分离，洗脱液在490nm处检测糖的特征吸收以及在280nm处检测蛋白质的吸收，选择羊反刍胃蛋白的洗脱峰进行收集，透析，脱盐，冷冻，浓缩，得到蛋白。层析柱中采用改性琼脂糖树脂作为填料。

26、本发明公开了琼脂糖基材料在提取羊反刍胃蛋白中的用途，琼脂糖基材料中具有砜基基团以及3-巯基丙酸异丙酯基团。

27、本发明由于采用了将琼脂糖树脂和二乙烯基砜混合于碳酸盐缓冲液中，经反应后制成含有烯基砜结构的活化琼脂糖树脂，然后再由活化琼脂糖树脂与3-巯基丙酸异丙酯反应，制备得到改性琼脂糖树脂，然后以改性琼脂糖树脂作为层析柱的填料，分离出羊反刍胃蛋白，羊反刍胃蛋白由新鲜羊反刍胃经一系列步骤制备得到，因而具有如下有益效果：羊反刍胃蛋白提取率高，羊反刍胃蛋白总还原能力强。因此，本发明是一种可用于分离羊反刍胃蛋白、羊反刍胃蛋白提取率高、羊反刍胃蛋白总还原能力强的羊反刍胃有效成分提取物的制备方法。