一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法和应用

本发明属于生物，尤其涉及一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法和应用。

背景技术：

1、旋毛虫是一种营寄生生活的多细胞寄生虫，其可以感染多种动物，并长期寄生在动物的肌细胞内。当人或动物食入含有感染性肌幼虫的肉制品后，经过胃蛋白酶的消化作用释放出旋毛虫。旋毛虫可以在感染6小时内侵入小肠上皮，并在此经历四次蜕皮发育为成虫。成虫在感染5天后开始产新生幼虫，持续到成虫被排除体外。新生幼虫可以借助血液循环或淋巴循环侵入宿主的肌细胞内，并建立长期感染。旋毛虫的三个发育时期均在同一个宿主体内，并在时间上相互重叠，这是其特有的寄生方式。肠道成虫的存活时间和新生幼虫成功迁移率是肌幼虫成功寄生的关键。因此，从防控旋毛虫感染以及制备疫苗的角度研究降低感染旋毛虫风险的主要阶段应聚焦于肠道成虫期和新生幼虫的迁移期。目前，旋毛虫的疫苗研究点包括：虫体的天然抗原、重组抗原和dna疫苗等。考虑到天然抗原制备困难且具备很强的不安全因素，其疫苗的应用有一定的难度。重组单一蛋白的成分简单、制备工艺完善、较低的生物安全隐患，使其成为了旋毛虫疫苗研究的重要方向之一。从旋毛虫寄生过程中筛选关键的抗原成分是重组蛋白疫苗研究的方向。

2、骨形态发生蛋白（bmp）是转化生长因子蛋白（tgf-β）超家族的成员之一，其可以通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶受体向细胞内部传导信号。bmp具有tgf-β蛋白典型的合成、分泌和激活特征，其在细胞内合成并被酶切开，形成两个依赖非共价键连接的部分，并且两个bmp形成一个稳定的、无蛋白活性的二聚体复合物，随后被释放到细胞外。在细胞外，其可以被整合素刺激并释放有活性的二聚体，作用于靶细胞表面的受体，引起生物学效应。bmp参与到动物生长发育的各个阶段，包括：铁新陈代谢、成骨细胞分化和胚胎分化等。旋毛虫的转化因子蛋白（ ts-tgh4）属于bmp家族，在旋毛虫的生长发育过程中扮演了重要角色，因此，我们对 ts-tgh4的活化位点进行预测并获得蛋白突变体，评价了 ts-tgh4突变体做为候选疫苗的潜在价值。为此，我们提出了一种重组骨形态发生蛋白突变体及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法，包括以下步骤：

4、步骤一、结合网站蛋白结构预测与氨基酸多序列比对结果，预测骨形态发生蛋白生物学活性的关键氨基酸位点，对相应的碱基进行突变，获得突变后的基因序列；

5、步骤二、构建表达质粒：选取xhoi和ndei内切酶位点，将原基因及突变后的基因序列克隆到pet28a载体内，然后将其转化到大肠杆菌dh5a感受态中，通过含有硫酸卡那霉素抗性的lb培养板筛选出阳性单克隆菌株，随后对单克隆菌株的质粒进行测序鉴定；扩大培养已鉴定的阳性克隆并提取质粒，将质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)中，再次筛选出阳性单克隆菌株，并对菌株进行测序鉴定；

6、步骤三、表达重组蛋白：将步骤二获得的阳性单克隆菌株进行培养，在37℃、120转/分钟的摇床内培养，当培养液的吸光度达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.1nmol的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）诱导剂，继续培养6-8小时，离心收集大肠杆菌并使用pbs缓冲液清洗大肠杆菌；对收集的大肠杆菌进行超声破碎，收集不溶于水的包涵体，并用8mol尿素溶解包涵体；

7、步骤四、纯化重组蛋白：使用äkta pure全自动蛋白质分离纯化仪对包涵体进行纯化分离，带有his标签的重组蛋白非特异性结合到镍柱，并被咪唑竞争洗脱，从而获得纯化后的重组蛋白。

8、一种上述制备方法制得的重组骨形态发生蛋白突变体。

9、一种上述重组骨形态发生蛋白突变体在制备抗旋毛虫感染预防制剂中的应用。

10、进一步的，包括以下步骤：

11、步骤五、重组蛋白免疫小鼠；

12、步骤六、评价重组蛋白对旋毛虫感染的免疫保护效果。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

14、1、本发明提出了一种骨形态发生蛋白的蛋白突变方案，通过突变关键位点氨基酸，使其丧失蛋白功能活性，并采用原核表达、纯化的方式获得单一的重组蛋白。使用重组骨形态发生蛋白与弗氏佐剂混合免疫小鼠，经过三次间隔14天的免疫程序，诱导小鼠产生高水平的抗体效价。小鼠经口感染旋毛虫，经过35天的寄生周期，小鼠肌肉内的旋毛虫数量的减少率被认定为重组蛋白的免疫保护力。结果显示重组骨形态发生蛋白突变体可以诱导小鼠产生高效价的抗体水平以及良好的免疫保护效果。

15、2、本发明将重组骨形态发生蛋白突变体应用在制备抗旋毛虫感染预防制剂中；旋毛虫衍生的重组骨形态发生蛋白突变体和有效的免疫保护效应属首次发现，对旋毛虫病的防治具有重要意义。

技术特征：

1.一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.一种根据权利要求1所述的制备方法制得的重组骨形态发生蛋白突变体。

3.一种根据权利要求2所述的重组骨形态发生蛋白突变体在制备抗旋毛虫感染预防制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明适用于生物技术领域，提供了一种重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法和应用，重组骨形态发生蛋白突变体的制备方法包括：构建无活性的重组骨形态发生蛋白突变体，重组蛋白的原核表达和纯化；应用步骤包括：重组蛋白免疫小鼠和评价其对旋毛虫感染的免疫保护效果。本发明中的重组骨形态发生蛋白突变体可以诱导小鼠产生高效价的血清特异性抗体，并对后续旋毛虫感染表现出良好的免疫保护效果。本发明将重组骨形态发生蛋白突变体应用在对旋毛虫感染的免疫保护效应的研究和相关疫苗的制备研究中，对预防旋毛虫感染具有重要意义。

技术研发人员：徐凝,刘一,梁悦,王学林,刘明远,白雪,张壮志,游锡火,骆学农,刘晓雷
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21