一种重组水泡性口炎病毒以及埃博拉出血热感染动物模型的构建方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种重组水泡性口炎病毒以及埃博拉出血热感染动物模型的构建方法。

背景技术：

1、埃博拉病毒病(ebola virus disease,evd)是由埃博拉病毒(ebola virus，ebov)引起的一种急性发热伴有严重出血的烈性传染病。埃博拉病毒(ebov)是丝状病毒科埃博拉病毒属的成员之一，可在人类和非人类灵长类动物(nhps)中引起严重的出血性疾病，病死率高达90％。目前，已有两种单克隆抗体用来治疗埃博拉病毒病：mab114(ansuvimab)和regn-eb3(inmazeb)。而研究ebov的难点在于，ebov是四级病原，需要在极高的生物安全等级实验室条件下进行操作，实验条件苛刻且成本较高，阻碍了针对ebov药物和疫苗的开发。因此，迫切需要经济和方便的动物模型以促进预防和治疗ebov的产品的开发。

2、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,vsv)反向遗传技术已广泛应用于重组病毒构建，具有安全性高的优势。目前虽然已有表达埃博拉病毒囊膜糖蛋白(gp)的重组水泡性口炎病毒的报道，但均为用于疫苗开发和抗体制备的重组病毒，致病性弱，尚未见可用于埃博拉病毒感染动物模型构建的重组病毒及其感染动物模型构建的报道。

技术实现思路

1、本发明提供表达埃博拉病毒囊膜糖蛋白的重组水泡性口炎病毒以及埃博拉出血热感染动物模型的构建方法。

2、基于现有技术存在问题，本发明旨在基于vsv反向遗传平台构建一种能够在生物安全二级实验室条件下(bsl-2)进行操作且能够用于埃博拉出血热感染动物模型构建的替代埃博拉病毒，进一步基于该替代病毒建立一种可用于体内评价抗ebov药物、抗体和疫苗的埃博拉出血热感染动物模型。

3、具体地，本发明提供以下技术方案：

4、第一方面，本发明提供一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含重组水泡性口炎病毒基因组；

5、所述重组水泡性口炎病毒基因组为将水泡性口炎病毒基因组中的g基因缺失，并在n基因和p基因之间插入埃博拉病毒gp基因得到；

6、或者，所述重组水泡性口炎病毒基因组为将水泡性口炎病毒基因组中的g基因缺失，在n基因和p基因之间插入埃博拉病毒gp基因，并在m基因和l基因之间插入标记蛋白编码基因得到。

7、影响重组水泡性口炎病毒感染性和致死性的因素众多，本发明在研发过程中意外地发现，埃博拉病毒gp基因在水泡性口炎病毒基因组中的插入位置会对重组病毒的致死性产生较大影响。与其他插入位置相比(例如插入在m基因和l基因之间)，在水泡性口炎病毒基因组的n基因和p基因之间插入埃博拉病毒gp基因，能够显著提高重组病毒对金黄地鼠的致死性。

8、本发明中，水泡性口炎病毒的g基因为编码水泡性口炎病毒糖蛋白(g)的基因，n、p、m、l基因分别为编码水泡性口炎病毒n蛋白、p蛋白、m蛋白和l蛋白的基因。埃博拉病毒gp基因为编码埃博拉病毒囊膜糖蛋白(gp)的基因。

9、以上所述的重组核酸分子优选为重组dna。

10、本发明中，所述埃博拉病毒优选为扎伊尔型埃博拉病毒。

11、本发明发现，与其他型埃博拉病毒相比，扎伊尔型埃博拉病毒的gp基因更有利于产生致死性感染，更适合用于埃博拉出血热感染动物模型的构建。

12、优选地，所述扎伊尔型埃博拉病毒gp基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

13、在本发明的一些实施方式中，所述重组核酸分子中还引入了标记蛋白编码基因，以便于通过检测荧光等标记信号方便重组病毒的检测。对于标记蛋白的种类，本发明没有特殊限制。

14、可选地，所述标记蛋白为荧光标记蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白。

15、在本发明的一些实施方式中，所述标记蛋白编码基因为egfp基因。

16、在本发明的一些实施方式中，所述水泡性口炎病毒基因组为水泡性口炎病毒印第安纳疫苗株(indiana)的基因组，其genbank登录号为j02428.1。

17、优选地，所述重组核酸分子还包含位于所述重组水泡性口炎病毒基因组上游的启动子。

18、优选地，所述重组核酸分子还包含位于所述重组水泡性口炎病毒基因组下游的丁肝病毒核酶序列。

19、优选地，所述启动子为cmv启动子和t7启动子。

20、cmv启动子和t7启动子的序列分别如seq id no.2所示序列的1-204bp、205-223bp所示。

21、丁肝病毒核酶序列如seq id no.2所示序列的11933-12008bp所示。

22、优选地，所述重组核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

23、第二方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料为重组载体或宿主细胞；

24、所述重组载体包含以上所述的重组核酸分子；

25、所述宿主细胞包含以上所述的重组核酸分子，或者包含所述重组载体。

26、优选地，所述重组载体为哺乳动物表达质粒。

27、所述重组载体为将以上所述的重组核酸分子插入哺乳动物表达质粒得到。对于哺乳动物表达质粒的种类，本发明没有特殊限制，所有能够在动物细胞中进行复制和蛋白表达的质粒均可。

28、在本发明的一些实施方式中，所述哺乳动物表达质粒为pcdna3.1。

29、以上所述的重组载体与辅助质粒共转染宿主细胞，能够通过病毒拯救得到表达埃博拉病毒gp蛋白的重组水泡性口炎病毒，且重组水泡性口炎病毒能够进行复制增殖和稳定传代。

30、以上所述的宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞。对于宿主细胞的种类，本发明没有特殊限制，其中，微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母等；动物细胞包括但不限于金黄仓鼠肾细胞(bsr)等。

31、第三方面，本发明提供一种重组水泡性口炎病毒，所述重组水泡性口炎病毒基因组为将水泡性口炎病毒基因组中的g基因缺失，并在n基因和p基因之间插入埃博拉病毒gp基因得到；

32、或者，所述重组水泡性口炎病毒基因组为将水泡性口炎病毒基因组中的g基因缺失，在n基因和p基因之间插入埃博拉病毒gp基因，并在m基因和l基因之间插入标记蛋白编码基因得到。

33、优选地，所述重组水泡性口炎病毒包含水泡性口炎病毒核蛋白、水泡性口炎病毒磷蛋白、水泡性口炎病毒基质蛋白、水泡性口炎病毒rna聚合酶以及埃博拉病毒囊膜糖蛋白(gp)，且不包含水泡性口炎病毒糖蛋白。

34、优选地，所述重组水泡性口炎病毒具有复制增殖能力。

35、优选地，所述埃博拉病毒为扎伊尔型埃博拉病毒。

36、优选地，优选地，所述扎伊尔型埃博拉病毒gp基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

37、在本发明的一些实施方式中，所述重组核酸分子中还引入了标记蛋白编码基因，以便于通过检测荧光等标记信号方便重组病毒的检测。对于标记蛋白的种类，本发明没有特殊限制。

38、可选地，所述标记蛋白为荧光标记蛋白，包括但不限于绿色荧光蛋白。

39、在本发明的一些实施方式中，所述标记蛋白编码基因为egfp基因。

40、在本发明的一些实施方式中，所述水泡性口炎病毒基因组为水泡性口炎病毒印第安纳疫苗株(indiana)的基因组，其genbank登录号为j02428.1。

41、优选地，所述重组水泡性口炎病毒基因组的核苷酸序列如seq id no.2的224-11932bp所示。

42、第四方面，本发明提供以上所述的重组水泡性口炎病毒的制备方法，所述方法包括：将包含以上所述的重组核酸分子的重组载体和辅助质粒导入宿主细胞中，得到重组宿主细胞，培养重组宿主细胞并收获释放的病毒。

43、优选地，所述辅助质粒为分别表达水泡性口炎病毒的rna聚合酶、核蛋白、磷蛋白和糖蛋白的四个哺乳动物表达质粒。

44、以上所述的辅助质粒可通过将水泡性口炎病毒的n基因、p基因、l基因和g基因分别连接至哺乳动物表达质粒得到。

45、利用上述重组载体和辅助质粒、采用本领域常规的重组病毒拯救方法即可获得上述重组水泡性口炎病毒。

46、第五方面，本发明提供以上所述的重组核酸分子或所述生物材料或所述重组水泡性口炎病毒的以下任一种应用：

47、(1)在制备表达埃博拉病毒gp蛋白的重组水泡性口炎病毒中的应用；

48、(2)在制备埃博拉病毒感染动物模型中的应用；

49、(3)在制备用于检测埃博拉病毒的中和抗体在样品中存在或其水平的试剂中的应用；

50、(4)在非疾病诊断和治疗目的的检测埃博拉病毒的中和抗体在样品中存在或其水平中的应用；

51、(5)在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒感染或由埃博拉病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

52、(6)在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒感染或由埃博拉病毒感染引起疾病的药物中的应用；

53、(7)在制备用于诊断埃博拉病毒感染或由埃博拉病毒感染引起疾病的试剂中的应用。

54、上述(1)中，所述应用为利用以上所述的重组核酸分子或所述生物材料制备表达埃博拉病毒gp蛋白的重组水泡性口炎病毒。

55、上述(2)中，所述动物模型优选为金黄地鼠模型。

56、上述(3)、(4)中，所述应用包括利用以上所述的重组水泡性口炎病毒进行埃博拉病毒中和抗体的检测。

57、上述(4)中，所述非疾病诊断和治疗目的的检测包括但不限于检测化学合成或体外表达的埃博拉病毒中和抗体。

58、上述(6)中，所述药物包括中和抗体等。

59、上述(7)中，可通过检测血清等样本中的中和抗体是否存在和/或其水平诊断是否感染埃博拉病毒或由埃博拉病毒感染引起的疾病。

60、上述应用中，由埃博拉病毒感染引起的疾病包括埃博拉病毒病。

61、第六方面，本发明提供一种埃博拉病毒感染动物模型的构建方法，所述方法包括：以所述重组水泡性口炎病毒对雌性金黄地鼠进行攻毒。

62、本发明的重组水泡性口炎病毒对小鼠、大鼠、豚鼠均不能产生致死性感染，但本发明意外地发现，该重组水泡性口炎病毒对雌性金黄地鼠能够产生致死性感染，感染后雌性金黄地鼠体重明显下降，出现凝血障碍以及严重的肝功能受损，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官均出现炎症或损伤，且眼部出现分泌物，并发展为与人类埃博拉病毒病患者相似的严重全身性疾病；雌性金黄地鼠在感染2-3天后全部死亡，组织病理学显示，重组病毒以肝细胞为靶点，其组织靶向性与野生型ebov相一致。因此，可通过以所述重组水泡性口炎病毒对雌性金黄地鼠进行攻毒构建埃博拉病毒感染动物模型，用于埃博拉病毒疫苗、抗体等药物、防治手段的开发。

63、上述构建方法中，所述雌性金黄地鼠的年龄为优选为2-4周龄。更优选为3周龄。本发明发现，与其他年龄的雌性金黄地鼠相比，上述年龄的雌性地鼠对重组病毒更敏感。

64、上述构建方法中，所述攻毒的方式优选为腹腔注射。本发明发现，在不同的攻毒方式中，只有通过腹腔注射的方式才能够使金黄地鼠全部致死；上述重组水泡性口炎病毒的致病性被证明是物种特异性、年龄相关、性别相关和注射途径决定的。

65、第七方面，本发明提供以上所述的方法构建得到的埃博拉病毒感染动物模型。

66、第八方面，本发明提供以上所述的构建方法构建得到的埃博拉病毒感染动物模型的以下任一种应用：

67、(1)在埃博拉病毒抗体的筛选或有效性评价中的应用；

68、(2)在埃博拉病毒疫苗的筛选或有效性评价中的应用；

69、(3)在用于预防和/或治疗埃博拉病毒的药物的筛选或有效性评价中的应用。

70、本发明的有益效果至少包括：本发明提供了表达埃博拉病毒囊膜糖蛋白(gp)的重组水泡性口炎病毒，该重组病毒对雌性金黄地鼠可产生致死性感染，且感染后的临床症状和生化、组织病变与人类感染埃博拉病毒相似，可作为埃博拉病毒的替代病毒，用于埃博拉出血热感染动物模型的构建，或用于埃博拉病毒中和抗体的检测，解决了因埃博拉病毒需要高生物安全等级实验室条件导致其疫苗、药物开发困难以及目前尚无能够对动物产生致死性感染的重组病毒的问题。

71、本发明基于所述表达埃博拉病毒囊膜糖蛋白(gp)的重组水泡性口炎病毒建立了金黄地鼠致死感染模型，该埃博拉出血热感染动物模型表现出发烧、体重减轻、多器官衰竭、严重葡萄膜炎和高病毒载量等疾病迹象，并发展为与人类埃博拉病毒病患者相似的严重全身性疾病。本发明利用该动物模型验证了马抗ebov免疫球蛋白和ebov亚单位疫苗的可用性，证明该动物模型是一种安全、有效、经济的工具，可用于bsl-2条件下快速临床前评估针对ebov的疫苗、抗体、药物等医疗对策。