一种酶组合及其在制备麦角硫因中的应用的制作方法

本发明涉及活性成分制备，尤其是涉及一种酶组合及其在制备麦角硫因中的应用。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine，egt)又名巯基组氨酸三甲基内盐。其左旋结构具有良好的生理活性，具有硫酮和硫醇两种形式的异构体。麦角硫因被认为是一种多功能的细胞生理保护剂，具有清除自由基，解毒，维持dna的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能；其主要存在于灵芝等食用菌、药用菌中，广泛应用于化妆品、功能性食品、动物饲料及其医药领域。麦角硫因对人体具有有益的作用。

2、相关技术中，生产麦角硫因的方法主要有物理提取法、化学合成法以及微生物合成法。其中，物理提取法的麦角硫因产出比较低，杂质多，难以规模化生产；化学合成法的生产成本高，难度大，易产生外消旋化和有毒物质，安全性难以保证；微生物合成法存在合成效率低，且容易受到微生物污染的问题。

3、因此，需要提供一种工艺简单、产量高、安全的麦角硫因的制备方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种酶组合，能够用于一锅法高效、便捷地制备麦角硫因。

2、本发明还提供一种麦角硫因的制备方法。

3、本发明还提供上述酶组合或制备方法在制备麦角硫因中的应用。

4、根据本发明的第一方面实施例的一种酶组合，包括：mbp-egt1、mbp-egt2；

5、所述mbp-egt1包括连接有mbp促溶标签的egt1酶；所述egt1酶具有a1)或a2)所示的氨基酸序列；

6、a1)、如seq id no.1第380～1254位所示的氨基酸序列；

7、a2)、在a1)所述氨基酸序列的n端和/或c端连接标签序列的氨基酸序列；

8、所述mbp-egt2包括连接有mbp促溶标签的egt2酶；所述egt2酶具有b1)或b2)所示的氨基酸序列；

9、b1)、如seq id no.2第380～904位所示的氨基酸序列；

10、b2)、在b1)所述氨基酸序列的n端和/或c端连接标签序列的氨基酸序列。

11、根据本发明的一些实施例，编码所述mbp-egt1的核苷酸序列如seq id no.3第1138～3762所示。

12、根据本发明的一些实施例，编码所述mbp-egt2的核苷酸序列如seq id no.4第1138～2712位所示。

13、根据本发明的一些实施例，所述标签序列为便于所述mbp-egt1和/或所述mbp-egt2检测、示踪和/或纯化的标签序列。

14、根据本发明的一些实施例，所述标签序列包括his标签序列、flag标签序列、ha标签序列、gst标签序列、myc标签序列中的至少一种。

15、根据本发明的一些实施例，所述mbp促溶标签和egt1酶之间通过连接肽1相连。

16、根据本发明的一些实施例，所述mbp促溶标签和egt2酶之间通过连接肽2相连。

17、根据本发明的一些实施例，所述连接肽1和/或所述连接肽2选自柔性连接肽、刚性连接肽、可剪切连接肽中的至少一种。

18、根据本发明的一些实施例，所述刚性连接肽包括(eaaak)n、(xp)n中的至少一种。

19、根据本发明的一些实施例，所述柔性连接肽包括(ggggs)n、(g)n中的至少一种。n为任意正整数。

20、根据本发明的一些实施例，所述可剪切连接肽包括tevsite酶切位点。

21、根据本发明的一些实施例，所述连接肽1和/或所述连接肽2的长度独立为15～25个氨基酸。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。连接肽1/连接肽2的选择以不影响mbp促溶标签和egt1酶/egt2酶的折叠和活性为宜。

22、根据本发明的一些实施例，所述酶组合中，所述mbp-egt1与所述mbp-egt2的质量比为1:(0.5～1.5)。例如：可以为1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.65、1:0.7、1:0.75、1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:5。

23、根据本发明的第二方面实施例的一种麦角硫因的制备方法，包括以下步骤：

24、在ph 6.5～7.5条件下，l-组氨酸在上述酶组合的催化下反应，得到麦角硫因。

25、根据本发明的一些实施例，具体包括以下步骤：

26、制备含上述组合酶、l-组氨酸、s-腺苷甲硫氨酸(sam)、l-半胱氨酸、磷酸吡多醛(plp)、还原剂的缓冲液，反应，即得所述麦角硫因；

27、所述缓冲液的ph为6.5～7.5。例如：ph可以为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

28、在mbp-egt1催化下，sam的甲基转移至l-组氨酸，使得l-组氨酸甲基化生成组氨酸甜菜碱；组氨酸甜菜碱与l-半胱氨酸形成c-s键，转化为组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜(cys-her)。

29、在mbp-egt2催化下，cys-her与plp结合形成醛亚胺中间体，醛亚胺中间体的α-碳再发生去质子化生成醌类中间体；随后醌类中间体的c-s键断裂生成麦角硫因亚磺酸和plp结合型氨基丙烯酸酯；当麦角硫因亚磺酸被释放后，底物结合位置的c156继续捕获麦角硫因亚磺酸，形成二硫键中间体；二硫键中间体可被还原剂(例如：二硫苏糖醇(dtt)、fe2+)或硫醇还原系统(例如硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶)进一步还原，释放终产物麦角硫因(egt)。

30、根据本发明的一些实施例，所述mbp-egt1的浓度为5mg/ml～30mg/ml。例如：可以为5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、15mg/ml、17mg/ml、20mg/ml、22mg/ml、25mg/ml、28mg/ml或30mg/ml。

31、根据本发明的一些实施例，所述酶组合中，所述mbp-egt1与所述mbp-egt2的质量比为1:(0.5～1.5)。例如：可以为1:0.5、1:0.55、1:0.6、1:0.65、1:0.7、1:0.75、1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:5。

32、根据本发明的一些实施例，所述l-组氨酸、s-腺苷甲硫氨酸、l-半胱氨酸的摩尔比为1:3～5:1～2。例如：可以为1:3:1、1:3.3:1、1:4:1、1:4.5:1、1:5:1、1:3:2、1:3.5:2、1:4:2、1:4.5:2或1:5:2。

33、根据本发明的一些实施例，所述l-组氨酸与所述plp的摩尔比为1:0.01～0.1。例如：可以为1:0.01、1:0.02、1:0.033、1:0.05或1:0.083。

34、根据本发明的一些实施例，所述mbp-egt1与所述l-组氨酸的质量摩尔比为1g:0.12～0.3mol。例如：可以为1g:0.12mol、1g:0.16mol、1g:0.2mol、1g:0.22mol、1g:0.24mol、1g:0.26mol、1g:0.28mol或1g:0.3mol。

35、根据本发明的一些实施例，所述还原剂包括dtt、fe2+中的至少一种。

36、根据本发明的一些实施例，所述缓冲液中，所述还原剂的浓度为0.01mm～12mm。例如：可以为0.01mm、0.1mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm或12mm。

37、根据本发明的一些实施例，所述还原剂包括dtt，所述缓冲液中的dtt浓度为0.01mm～2mm。例如：可以为0.05mm、0.1mm、0.3mm、0.5mm、0.8mm、1mm、1.3mm、1.5mm、1.8mm或2mm。

38、根据本发明的一些实施例，所述还原剂包括fe2+，所述缓冲液中的fe2+浓度为0.05mm～10mm。例如：可以为0.1mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。

39、根据本发明的一些实施例，所述反应的温度为25℃～35℃。例如：可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。

40、根据本发明的一些实施例，所述反应的转速为20rpm～100rpm。例如：可以为20rpm、30rpm、40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm或100rpm。

41、根据本发明的一些实施例，所述反应的时间不低于6h。

42、本文中，“不低于”指高于或等于，应理解为包含本数。

43、根据本发明的一些实施例，所述反应的时间为6h～18h。例如：可以为6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h或18h。

44、根据本发明的一些实施例，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。

45、根据本发明的一些实施例，所述缓冲液包括5～20mm tris-hcl、10～100mm nacl。

46、根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括纯化处理。所述纯化处理包括：

47、加入乙醇处理，固液分离；通过层析柱分离上清液中的所述麦角硫因。

48、乙醇处理用于除杂。

49、根据本发明的一些实施例，所述层析柱包括c18层析柱、葡聚糖凝胶中的至少一种。

50、根据本发明的一些实施例，分离上清液中的所述麦角硫因可通过依次用水、10v/v％～60v/v％乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液。

51、根据本发明的一些实施例，所述mbp-egt1或mbp-egt2的制备方法包括如下步骤：

52、将编码所述mbp-egt1或mbp-egt2的核酸分子导入受体细胞，得到重组受体细胞；培养所述重组受体细胞，即得所述mbp-egt1或mbp-egt2。

53、根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以是dna(如cdna、基因组dna或重组dna)或rna(如mrna等)。

54、根据本发明的一些实施例，编码所述mbp-egt1的核酸分子为c1)～c3)中的至少一种；

55、c1)、具有如seq id no.3所示的核苷酸序列的核酸分子；

56、c2)、在c1)所示核酸分子中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸分子；

57、c3)、与c1)所示核酸分子具有至少80％同源性，且编码所述mbp-egt1的核酸分子。根据本发明的一些实施例，编码所述mbp-egt2的核酸分子为d1)～d3)中的至少一种；

58、d1)、具有如seq id no.4所示的核苷酸序列的核酸分子；

59、d2)、在d1)所示核酸分子中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸分子；

60、d3)、与d1)所示核酸分子具有至少80％同源性，且编码所述mbp-egt2的核酸分子。

61、本文中，术语“同源性”指核苷酸序列之间的相似性。同一性可以通过肉眼或计算机软件进行评价。

62、本文中，所述至少80％同一性可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

63、根据本发明的一些实施例，所述受体细胞不包括繁殖材料。

64、根据本发明的一些实施例，所述受体细胞包括微生物、动物细胞中的至少一种。

65、根据本发明的一些实施例，所述微生物包括细菌(如大肠杆菌)、真菌(如酵母)、藻中的至少一种。

66、根据本发明的一些实施例，所述动物细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞中的至少一种

67、根据本发明的一些实施例，将所述核酸分子导入所述受体细胞可通过热激法或者电转化法实现。

68、根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以重组载体的形式导入所述受体细胞。

69、根据本发明的一些实施例，所述mbp-egt1和/或所述mbp-egt2可以通过重组质粒(如pet28a、pet32a或pet30b)游离表达；也可以提供重组质粒(如ppiczαa、ppic9k或ppic9)在基因组上整合表达。

70、根据本发明的第三方面实施例的上述酶组合或制备方法在制备麦角硫因中的应用。

71、本发明至少具有如下有益效果：

72、实施例的酶组合能够用于体外高效催化合成麦角硫因。通过在mbp-egt1、mbp-egt2上连接纯化标签等，还可以利于后续回收酶组合，进行重复利用，减少成本。

73、实施例的麦角硫因的制备方法应用上述酶组合实现，具有步骤简单，成本低、产能高、工艺周期短的优点，可用于规模化生产，产量可达0.5g/l以上，转化率达85％以上。制备得到的麦角硫因绿色环保、无微生物污染，杂质少。

74、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。