一种无需蛋白酶K核酸提取或纯化试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学检测，具体涉及一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒。

背景技术：

1、从非洲猪瘟到新型冠状病毒，前者是动物烈性传染病，给养猪业造成了巨大的经济损失；后者是新发人类传染病，对人类健康和生命构成了巨大威胁，导致社会经济损失惨重。因此快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着检测技术的发展，病原核酸检测由于其高敏感和高特异的检测性能，已成为主流的检测手段。

2、核酸提取是病原核酸检测的第一步，目前最常用的核酸提取方法是磁珠吸附法和硅胶膜吸附柱法。硅胶膜吸附柱法快速简便，获得的核酸纯度高，但是对小片段dna或rna提取效率不高，而且不适用于自动化提取流程。磁珠法以超顺磁纳米微球为载体，能吸附核酸，快速分离纯化dna或rna，提取过程无需离心或过滤，也可以使用自动化工作平台的形式完成，提取通量高、自动化程度好。

3、蛋白酶k，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。由于蛋白酶k在尿素和sds中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而在病毒核酸提取中可裂解病毒外壳蛋白，暴露核酸；可降解与核酸紧密结合的组蛋白，使核酸游离到提取液中，有利于进一步纯化；同时蛋白酶k还能够降解rna酶，防止病毒rna降解，有利于核酸检测。但在核酸提取过程中，增加蛋白酶k，增加了操作步骤、提取时间以及试剂成本，对于样本量较大的核酸提取来说，耗时耗力。除此之外，蛋白酶k在提取过程中清洗不彻底，会对下游pcr产生抑制作用。

4、目前磁珠法提取仍存在提取时间长的问题，整个提取过程通常需要30分钟左右，在应对紧急事件时，不能满足大量样本下更简单、更快速的核酸提取需求。因此，亟需改进磁珠发核酸提取体系，开发出一套更简单、更快速、适用于自动化工作平台的核酸提取纯化试剂，为病原核酸检测提供高质量核酸模板，提高检测效率和检测准确度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，解决现有技术中提取时间长，蛋白酶k清洗不彻底对下游pcr反应有抑制的技术问题。

2、本发明公开了一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，包括裂解液，所述裂解液包括1.0mol/l～5.0mol/l的异硫氰酸胍，10mmol/l～50mmol/l的乙酸钠，10mmol/l～30mmol/l的edta，0.5mol/l～5.0mol/l的nacl，质量百分含量为0.1％～3％的尿素、体积比为10％～70％的异丙醇，ctab和n-月桂酰肌氨酸钠，所述ctab和n-月桂酰肌氨酸钠物质的量浓度比为10～50。

3、进一步的，所述ctab的浓度为10mmol/l～30mmol/l，n-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5mmol/l～2mmol/l；

4、优选地，对于新冠拭子样本，ctab与n-月桂酰肌氨酸钠的浓度分别为20mm和1.5mm；对于口鼻拭子样本，ctab与n-月桂酰肌氨酸钠的浓度分别为15mm和1.0mm。

5、优选地，对于新冠拭子样本，所述裂解液包括3mol/l的异硫氰酸胍、30mmol/l的乙酸钠、10mmol/l的edta、3mol/l的nacl、质量百分含量为2％的尿素和体积比为20％的异丙醇；对于非洲猪瘟样本，所述裂解液包括3.5mol/l的异硫氰酸胍、30mmol/l的乙酸钠、10mmol/l的edta、3mol/l的nacl、质量百分含量为2％的尿素和体积比为20％的异丙醇；

6、进一步的，所述试剂盒还包括洗涤液1，洗涤液1包括10mmol/l～50mmol/l的乙酸钠、5mmol/l～30mmol/l的edta、0.5mol/l～3.0mol/l nacl、30％～70％体积比的异丙醇或无水乙醇；

7、优选地，所述洗涤液1包括15mmol/l的乙酸钠，20mmol/l的edta，0.8mol/l的nacl和体积比为50％的异丙醇；

8、进一步的，所述试剂盒还包括洗涤液2，洗涤液2包含0.5mmol/l～3mmol/l的柠檬酸钠、1mmol/l～10mmol/l的edta、40％～90％体积比的异丙醇或无水乙醇；洗涤液中的柠檬酸三钠可以控制反应体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，有利于核酸的稳定，减少对核酸的破坏。

9、优选地，所述洗涤液2包括2.0mmol/l的柠檬酸钠，1.0mmol/l的edta，体积比为60％的无水乙醇；

10、进一步的，所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括0.1mmol/l～10mmol/l的tris；

11、优选地，所述洗脱液中tris浓度为0.1mmol/l；

12、进一步的，所述试剂盒还包括磁珠混合液，所述磁珠混合液包括磁珠和磁珠稀释液，所述磁珠所带官能团包括但不限于带氨基、羟基、羧基或硅羟基，所述磁珠在磁珠混合液中的浓度为15mg/ml；

13、进一步的，所述磁珠稀释液包括0.1mol/l～2mol/l的氯化钠、0.1mmol/l～5mmol/l的edta和30％～90％体积比的异丙醇。

14、优选地，磁珠混合液中所带官能团为硅羟基。

15、与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

16、1.本发明的核酸提取或纯化试剂盒，通过对裂解液的组分及浓度进行适当调整，得到的裂解体系裂解能力强，裂解效率高，在不含蛋白酶k的情况下，提取效率与含有蛋白酶k的试剂盒提取效率相当；

17、2.本发明的核酸提取或纯化试剂盒，简化了核酸提取纯化的过程，减少了一个检测样本所需要的时间，有利于大量样本的临床检测；

18、3.本发明的核酸提取或纯化试剂盒，提取体系不包含蛋白酶k，因此解决了因蛋白酶k清洗不彻底导致的下游pcr反应的影响，且提高了提取效率。

技术特征：

1.一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：包括裂解液，所述裂解液包括1.0mol/l～5.0mol/l的异硫氰酸胍，10mmol/l～50mmol/l的乙酸钠，10mmol/l～30mmol/l的edta，0.5mol/l～5.0mol/l的nacl，质量百分含量为0.1％～3％的尿素、体积比为10％～70％的异丙醇，ctab和n-月桂酰肌氨酸钠，所述ctab和n-月桂酰肌氨酸钠物质的量浓度比为10～50。

2.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述ctab的浓度为10mmol/l～30mmol/l，n-月桂酰肌氨酸钠的浓度为0.5mmol/l～2mmol/l。

3.根据权利要求2所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：对于新冠拭子样本，ctab与n-月桂酰肌氨酸钠的浓度分别为20mm和1.5mm；对于口鼻拭子样本，ctab与n-月桂酰肌氨酸钠的浓度分别为15mm和1.0mm。

4.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：对于新冠拭子样本，所述裂解液包括3mol/l的异硫氰酸胍、30mmol/l的乙酸钠、10mmol/l的edta、3mol/l的nacl、质量百分含量为2％的尿素和体积比为20％的异丙醇；对于非洲猪瘟样本，所述裂解液包括3.5mol/l的异硫氰酸胍、30mmol/l的乙酸钠、10mmol/l的edta、3mol/l的nacl、质量百分含量为2％的尿素和体积比为20％的异丙醇。

5.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤液1，洗涤液1包括10mmol/l～50mmol/l的乙酸钠、5mmol/l～30mmol/l的edta、0.5mol/l～3.0mol/l nacl、30％～70％体积比的异丙醇或无水乙醇。

6.根据权利要求5所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述洗涤液1包括15mmol/l的乙酸钠，20mmol/l的edta，0.8mol/l的nacl和体积比为50％的异丙醇。

7.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗涤液2，洗涤液2包含0.5mmol/l～3mmol/l的柠檬酸钠、1mmol/l～10mmol/l的edta、40％～90％体积比的异丙醇或无水乙醇。

8.根据权利要求7所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述洗涤液2包括2.0mmol/l的柠檬酸钠，1.0mmol/l的edta，体积比为60％的无水乙醇。

9.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液包括0.1mmol/l～10mmol/l的tris。

10.根据权利要求1所述的一种无需蛋白酶k核酸提取或纯化试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括磁珠混合液，所述磁珠混合液包括磁珠和磁珠稀释液，所述磁珠所带官能团包括但不限于带氨基、羟基、羧基或硅羟基，所述磁珠在磁珠混合液中的浓度为15mg/ml。

技术总结
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种无需蛋白酶K核酸提取或纯化试剂盒，包括裂解液，所述裂解液包括1.0mol/L～5.0mol/L的异硫氰酸胍，10mmol/L～50mmol/L的乙酸钠，10mmol/L～30mmol/L的EDTA，0.5mol/L～5.0mol/L的NaCl，质量百分含量为0.1％～3％的尿素、体积比为10％～70％的异丙醇，CTAB和N‑月桂酰肌氨酸钠，所述CTAB和N‑月桂酰肌氨酸钠物质的量浓度比为10～50。本发明的核酸提取或纯化试剂盒，通过对裂解液的组分及浓度进行适当调整，得到的裂解体系裂解能力强，裂解效率高，在不含蛋白酶K的情况下，提取效率与含有蛋白酶K的试剂盒提取效率相当。

技术研发人员：卜振中,汪康游,宁丽丽,李红东,李明
受保护的技术使用者：西安天隆科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8