一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体地，涉及一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用。

背景技术：

1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori,hp)是一种螺旋形、微需氧的革兰氏阴性杆菌，在美国卫生及公共服务部发布的第15版致癌物报告中，hp被列为明确致癌物。hp感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者发展为胃癌或黏膜相关组织淋巴瘤，严重危害人类的健康。在我国居民人口中，hp的感染率为59％，是重要的公共卫生问题。

2、根除幽门螺杆菌通常采用四联疗法，即两种抗生素、胃黏膜保护剂和质子泵抑制剂联合治疗。用于治疗幽门螺杆菌感染的抗生素主要有阿莫西林、克拉霉素、四环素、左氧氟沙星、甲硝唑、呋喃唑酮等。然而，临床治疗中已发现hp对抗生素耐药性的快速发展。在过去二十年中，全球范围内报告了hp抗生素耐药性的增加，同时根除成功率持续下降，各个国家或地区推荐的一线方案的治疗指南对大约10～30％患者治疗持续失败。除阿莫西林、四环素和呋喃唑酮的耐药率保持在0～5％，克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率已达20～45％，甲硝唑的耐药率则达到40～70％。同时尽管四环素和呋喃唑酮的耐药率较低，但二者的用药十分严格，只能在初次治疗失败后才会施用，并且2018年国家药监局也颁布了修订呋喃唑酮片说明书公告，将呋喃唑酮限用于“难以根除的hp感染”。甲硝唑由于其高耐药率，已经不在临床考虑范围。所以，幽门螺杆菌耐药性的检测评定对于临床治疗及根除hp具有重要的指导意义。

3、目前，现有技术中通常通过检测幽门螺杆菌的耐药基因型来评定其耐药性。cn114592081a公开了arms-pcr的方法检测幽门螺杆菌耐药基因突变，存在以下几个问题：1、△ct cut-off值取决于突变位点的外控ct值，每一管pcr反应必须检测外控ct值且外控ct值须保持一致，批间一致性无法保证；2、上下游引物均进行了硫代修饰，提高检测成本，增加病人的检测费用；3、没有菌种鉴定基因引物探针，无法判断是否感染野生型幽门螺杆菌。cn111850154a公开了一种利用多重荧光pcr溶解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，但是结果判读繁琐，野生型和突变型的溶解峰需要人工查验，耗费大量时间。因此，目前缺少快速、准确且便捷地检测幽门螺杆菌的耐药基因并分型的方法。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种检测突变位点的单碱基替换的上游引物。

3、本发明的第二个目的是提供一种检测突变位点的单碱基替换的引物组。

4、本发明的第三个目的是提供所述引物组在制备幽门螺杆菌耐药基因的检测产品中的应用。

5、本发明的第四个目的是提供一种检测幽门螺杆菌的耐药基因的突变位点的引物探针组合物。

6、本发明的第五个目的是提供所述引物探针组合物在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒。

8、为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

9、本发明提出了一种新的检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法，该方法不仅简化了探针和引物的设计与数量，可多个突变位点共用一对下游引物和探针，无需一个位点设计一对引物探针，大大节省成本，同时还只会对突变型核酸进行扩增，野生型核酸无扩增，判读结果简单。

10、一种检测突变位点的单碱基替换的上游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；

11、将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为x1，x1在非模板链上的互补碱基记为x1’；将模板链上的x1下游第一位碱基记为y，y在非模板链上的互补碱基记为y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为x2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为y”和z，y”与y’的碱基种类不同，z与x2的碱基种类相同；

12、x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’的碱基种类为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种；

13、x2和x1’依次为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’依次为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种。

14、优选地，所述x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，所述上游引物中的z还设有锁核酸修饰。

15、一种检测突变位点的单碱基替换的引物组，包含上游引物和下游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；

16、将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为x1，x1在非模板链上的互补碱基记为x1’；将模板链上的x1下游第一位碱基记为y，y在非模板链上的互补碱基记为y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为x2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为y”和z，y”与y’的碱基种类不同，z与x2的碱基种类相同；

17、x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’的碱基种类为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种；

18、x2和x1’依次为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’依次为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种。

19、优选地，所述x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，所述上游引物中的z还设有锁核酸修饰。

20、优选地，所述突变位点有若干个，且相隔距离为1bp～12bp，则所述引物组包含若干个所述上游引物和1个所述下游引物。

21、任一所述引物组在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

22、一种检测幽门螺杆菌耐药基因的引物探针组合物，包含探针和引物组，所述引物组，包含上游引物和下游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；

23、将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为x1，x1在非模板链上的互补碱基记为x1’；将模板链上的x1下游第一位碱基记为y，y在非模板链上的互补碱基记为y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为x2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为y”和z，y”与y’的碱基种类不同，z与x2的碱基种类相同；

24、x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’的碱基种类为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种；

25、x2和x1’依次为a-g、g-a、t-t、t-c、c-t或c-c中的一种，则调整y”的碱基种类使得y”和y’依次为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种。

26、优选地，所述x2和x1’的碱基种类为a-t、t-a、a-c、c-a、t-g、g-t、c-g、g-c、a-a或g-g中的一种，所述上游引物中的z还设有锁核酸修饰。

27、优选地，所述突变位点有若干个，且相隔距离为1bp～12bp，则所述引物组包含若干个所述上游引物和1个所述下游引物。

28、更优选地，所述引物探针组合物包含1个所述探针。

29、优选地，所述耐药基因包括幽门螺杆菌的23s rrna基因和gyra基因。

30、更优选地，所述23s rrna基因的突变位点包括a2142g、a2143g、a2143c和a2144g；a2142g的参考基因组为ab088058.1和ab088057.1；a2143g的参考基因组为ab088062.2、ab088059.1、ab088060.1、ab088064.1、ab088065.1和ab088061.1；a2143c的参考基因组为ab088051.1；a2144g的参考基因组为ab162858.1；

31、所述gyra基因的突变位点包括a260t、c261a、c261g、g271a、c271a、g271t和a272g；a260t的参考基因组为lc425776.1；c261a的参考基因组为lc567331.1、lc567371.1和lc425777.1；c261g的参考基因组为lc425756.1、lc425776.1和lc425785.1；c271a的参考基因组为lc567329.1、lc567376.1和lc425760.1；g271a的参考基因组为lc425770.1；g271t的参考基因组为lc567137.1、lc567377.1和lc567140.1；a272g的参考基因组为lc567138.1、lc567372.1和lc567136.1。

32、进一步优选地，检测所述23s rrna基因的突变位点的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1～3所示；检测所述gyra基因的突变位点的上游引物的核苷酸序列如seq idno.6～11所示；

33、其中，核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物检测23s rrna基因的a2142g；核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物检测23s rrna基因的a2143g和/或a2143c；核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物检测23s rrna基因的a2144g；核苷酸序列如seq idno.6所示的上游引物检测gyra基因的a260t；核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物检测gyra基因的c261a；核苷酸序列如seq id no.8所示的上游引物检测gyra基因的c261g；核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物检测gyra基因的c271a和/或g271a；核苷酸序列如seq id no.10所示的上游引物检测gyra基因的g271t；核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物检测gyra基因的a272g。

34、更进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no.2所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。

35、更进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。

36、更进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。

37、更进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no.10所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。

38、更进一步优选地，所述核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。

39、进一步优选地，检测所述23s rrna基因的突变位点的下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；检测所述gyra基因的突变位点的下游引物的核苷酸序列如seq idno.12所示。

40、任一所述引物探针组合物在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

41、一种检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒，包含任一所述引物探针组合物。

42、优选地，还包含pcr反应试剂。

43、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

44、与检测幽门螺杆菌耐药基因突变位点的常用方法arms-pcr相比，本发明不必针对每一个突变位点设计一对引物探针组合，在灵敏度保持相当的情况下，本发明中检测10个突变位点可仅用两条探针实现，且10个突变位点可只用一管反应全部检出，操作简便，经济高效。并且本发明的pool-arms方法的最低检测限仅为1pg/μl，特异性高，重复性好，结果准确可靠，极大提高了幽门螺旋杆菌耐药性的临床判定效率，具有广阔的应用前景。