一种用于小麦原生质体分离的酶解液及分离方法和应用与流程

本文属于生物，具体涉及一种用于小麦原生质体分离的酶解液及分离方法和应用。

背景技术：

1、多细胞生物由多种形态功能不同的细胞组成，细胞之间转录组水平的差异亟待深入研究，单细胞rna测序技术的产生为探索单细胞水平的基因表达谱提供了可能。随着单细胞rna测序的日趋成熟，单细胞领域内的文章也呈现井喷式爆发。目前单细胞测序技术在肿瘤、免疫、发育等方向获得了良好的应用，由于植物细胞存在细胞壁，制备原生质体有一定难度，使得单细胞测序技术在植物领域发展缓慢，目前单细胞测序在植物中的报道还比较有限。植物细胞壁主要由纤维素和果胶构成，只有将纤维素和果胶去除，才能得到原生质体进行单细胞测序。如何快速简单的制备出高质量的原生质体，成为单细胞测序的关键技术。

2、小麦(triticum aestivum l.)属禾本科小麦属，是重要的经济作物。目前还没有小麦叶片分离原生质体用于单细胞测序的相关报道，原因在于原生质体制备需要去除细胞壁，造成细胞破碎，进而导致细胞捕获率偏低。因此需要建立一种简单高效快速的小麦叶片原生质体单细胞分离的方法，这对于单细胞测序技术在小麦中的发展有着重要作用，可以为小麦其他部位的单细胞制备提供参考，推动单细胞测序在小麦中的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的不足，本文创造性的提供了一种用于制备小麦特别是小麦叶片原生质体单细胞悬液的酶解液及制备方法。采用本文的酶解液和制备方法制成的原生质体单细胞悬液，细胞活性高，单细胞分选的细胞捕获率高，可用于单细胞转录组测序文库的构建，应用价值高。

2、在第一方面，提供了一种酶解液，该酶解液中的酶包括纤维素酶和果胶酶，其中，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为(5-30)：1。

3、在一些实施方式中，所述纤维素酶和果胶酶的质量比为5:1、6:1、8:1、10:1、12:1、14:1、15:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、38:1、30:1或它们之间的任意值，优选为(5-20)：1，更优选为(10-20)：1，进一步优选为(12-16)：1。

4、在一些实施方式中，所述酶解液中的酶由纤维素酶和果胶酶组成。

5、在一些实施方式中，所述纤维素酶为产自绿色木霉(trichoderma viride)的纤维素酶，优选为产自绿色木霉的纤维素酶r-10。

6、在一些实施方式中，所述果胶酶为产自日本曲霉(aspergillus japonicus)或根霉菌属(rhizopus)的果胶酶，优选为产自日本曲霉的果胶酶y-23。

7、在一些实施方式中，所述酶解液中的酶包括或由以下组分组成：1-5(例如为1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5)％(w/v)的纤维素酶和0.02-0.5％(例如为0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45或0.5)(w/v)果胶酶。

8、在一些实施方式中，所述酶解液中的酶包括或由以下组分组成：1-2％(w/v)的纤维素酶和0.05-0.2％(w/v)果胶酶。

9、在一些实施方式中，所述酶解液中的酶包括或由以下组分组成：1.2-1.8％(w/v)的纤维素酶和0.08-0.12％(w/v)果胶酶。

10、本文提供的酶解液中添加产自绿色木霉的纤维素酶r-10和产自日本曲霉的果胶酶y-23，提高了酶解效率，有利于叶片组织快速酶解释放原生质体，保持细胞的完整性。

11、在一些实施方式中，所述酶解液进一步包括甘露醇、kcl、mgcl2、2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)、cacl2和bsa中的至少一种。

12、在一些实施方式中，所述酶解液进一步包括：0.2-0.6m甘露醇、10-30mm kcl、10-30mm mgcl2、5-20mm mes、5-20mm cacl2和0.05-0.2％(w/v)bsa。

13、在一些实施方式中，所述酶解液的ph值为5.5-6.0。

14、在一些具体实施方式中，所述酶解液包括：0.4m甘露醇、20mm kcl、20mm mgcl2、20mm mes(ph＝5.7)、10mm cacl2、0.1％(w/v)bsa(牛血清蛋白)、1.5％(w/v)纤维素酶r-10(产自绿色木霉)、0.1％(w/v)果胶酶y-23(产自日本曲霉)，酶解液需调ph值为5.7并且使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

15、在第二方面提供了一种小麦原生质体的分离方法，包括使用第一方面所述的酶解液处理小麦组织。

16、在一些实施方式中，所述小麦组织为小麦叶片。

17、在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：

18、(1)将所述小麦组织长条置于所述酶解液中进行酶解处理；

19、(2)将酶解处理后的酶解产物进行过滤和重悬，获得原生质体重悬液；

20、(3)将蔗糖溶液加入所述原生质体重悬液的下方，进行离心处理，吸取中间层分层相得到分离的小麦原生质体。

21、在一些实施方式中，所述方法还包括步骤(4)将获得的小麦原生质体进行重悬，得到小麦原生质体的单细胞悬液。

22、在一些实施方式中，步骤(1)中，所述酶解处理包括在冰浴状态下抽真空后，置于20-35℃(例如为25℃)下避光孵育1-3h(例如为1-2h)。优选地，所述酶解处理在转速为40-60rpm(例如为50rpm)的条件下进行。优选地，所述抽真空时间为10min，抽真空度至-0.05mpa。

23、在一些实施方式中，步骤(2)中，采用孔径为60-80μm(例如为70μm)的细胞筛进行所述过滤。

24、在一些实施方式中，步骤(2)还包括在所述重悬之前进行洗涤。优选地，所述洗涤在4℃，80-150rcf离心3-8min进行，例如在4℃，100rcf离心5min。

25、在一些实施方式中，步骤(3)中，所述离心处理包括在4℃，800-1500rpm离心3-10min，例如在4℃，1000rpm离心5min。

26、在一些实施方式中，步骤(3)中，所述蔗糖溶液与所述原生质体重悬液的体积比为1:(0.8-1.2)，例如为1:1。

27、在一些实施方式中，步骤(4)中，所述洗涤包括在4℃，80-150rcf离心3-8min，例如在4℃，100rcf离心5min。

28、在一些实施方式中，优选地，所述方法还包括在步骤(1)之前将浸泡在甘露醇溶液中的小麦切成宽度为0.3-0.6mm例如0.5mm的长条。

29、在一些实施方式中，所述甘露醇溶液为0.5-1m例如为0.65m的甘露醇水溶液。

30、在一些实施方式中，用于所述洗涤的洗涤液包括nacl、kcl、cacl2和mes，ph值为5.5-6.0。优选地，所述洗涤液包括140-160mm nacl、4-8mm kcl、120-140mm cacl2、1-3mmmes，ph值为5.7。在一些具体实施方式中，所述洗涤液包括154mm nacl、5mm kcl、125mmcacl2、2mm mes(ph＝5.7)，调ph值为5.7，并且使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

31、在一些实施方式中，用于所述重悬的细胞重悬液包括甘露醇、mgcl2和mes，ph值为5.5-6.0。优选地，所述细胞重悬液包括0.3-0.5m甘露醇、10-20mm mgcl2、2-5mm mes，ph值为5.7。在一些具体实施方式中，所述细胞重悬液包括0.4m甘露醇、15mm mgcl2、4mm mes(ph＝5.7)，调ph值为5.7，并且使用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

32、在一些实施方式中，所述蔗糖溶液为18-25％，优选20％的蔗糖水溶液。

33、在一些实施方式中，所述小麦的幼苗生长周期为3-4周，优选地，选取第三叶或第四叶并去除叶尖和叶柄。

34、上述分离方法采用本文提供的酶解液，提高了酶解效率，有利于小麦叶片组织快速酶解释放原生质体，不破坏细胞的完整性；并且酶解全程低速摇动，有助于组织释放原生质体，同时低速摇动避免细胞受到外力而损伤。进一步还采用蔗糖溶液离心去除碎片，大大缩短了得到干净的原生质体所需的时间，降低成本，在使用华大c4平台进行细胞分选时提高了细胞捕获率。

35、在第三方面，提供了采用第二方面所述的分离方法获得的小麦原生质体单细胞悬液。

36、在第四方面，提供了第一方面所述的酶解液、第二方面所述的分离方法或第三方面所述的小麦原生质体单细胞悬液在单细胞分选、测序或转录组文库构建中的应用。

37、在一些实施方式中，将所述的单细胞悬液置于冰上，于30min内完成单细胞分选与液滴生成，优选地，单细胞分选使用华大c4平台完成。

38、采用本文的酶解液和原生质体的分离方法获得的叶片原生质体单细胞悬液，细胞活性高，单细胞分选的细胞捕获率高，可用于单细胞转录组测序文库的构建。